破血化瘀，填精補髓方劑對腦出血大鼠腦血腫周圍組織生長因子的表達

任吉祥 畢鐵琳 周翔宇 王海燕

(長春中醫藥大學附屬醫院， 吉林 長春 130021)

腦出血(ICH)是具有病死率、致殘率高，并發癥多等特點，已發展成為危害人類健康的主要疾病之一〔1〕。雖然ICH后神經細胞凋亡的啟動機制尚不十分清楚，但大量研究發現誘導ICH后細胞凋亡的因素很多，如缺血導致的自由基瀑布效應〔2〕，炎性反應，其細胞因子的分泌表達，凝血酶的作用等〔3〕。中醫藥在治療腦卒中恢復期神經功能恢復、重建等方面具有毒副作用小，療效確切等優點〔4〕。在“髓虛毒損”的腦病發病病機關鍵指導下，將出血性腦卒中“破血化瘀，豁痰開竅，泄熱醒神”的治療大法進一步創新，提出了“破血化瘀，填精補髓”治療總則。由水蛭、生大黃、生蒲黃、虻蟲、瓜蔞、三七、石菖蒲、龜板膠等組成“破血化瘀，填精補髓”中藥湯劑是作者所在研究團隊在長期臨床實踐中總結出來的重要方劑，能有效改善腦出血患者的臨床癥狀，提高患者的日常生活能力〔5〕。實驗擬以醒腦健神膠囊為藥性對照藥物，觀察破血化瘀，填精補髓方劑對急性期ICH大鼠腦組織中腦源性神經營養因子(BDNF)、酪氨酸激酶 B(TrKB)及血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響，進一步探討ICH后大鼠神經元的保護性作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物 清潔級Wistar大鼠150只，鼠齡8 w，雌雄不限，體質量150～160 g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(吉)2011-0063。動物分籠飼養，室溫維持在20℃～25℃，濕度40%～70%，光照條帶強度15～20Lux，大鼠自由飲水和攝食。實驗中對動物的操作符合科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物指導性意見》。

1.1.2藥物 破血化瘀，填精補髓法實驗方劑由水蛭(山東，水蛭全體呈圓柱形)8 g、生大黃10 g(青海，莖紅色)、生蒲黃15 g(江蘇，黃色粉末)、虻蟲5 g(江蘇，形似蜜蜂，體中等，黃綠色)、瓜蔞20 g(安徽，果實近球形，熟時橙紅色，光滑)、三七10 g(云南，光滑無毛，綠色或帶多數紫色細縱條紋)、石菖蒲15 g(杭州，其根莖具氣味，葉全緣，排成二列)、龜板膠10 g(河南，四方形的扁塊，褐色略帶微綠)組成，采用傳統煎藥法取適量藥材置于砂鍋中，加水浸泡3 min，煮沸，冷卻，過濾去渣后取藥液進行濃縮，使1 ml藥液中含生藥1 g，4℃保存備用。醒腦健神膠囊(批號：111216)，主要由牛黃、郁金、菖蒲、膽南星、虻蟲、川芎組方)，由吉林省中醫院制劑室制備。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 將ICH模型成功大鼠120只，隨機分成五組：模型組，高、中、低劑量組，陽性藥組，每組24只；另設假手術組各24只；每組分為四個時間點，分別為(1、3、7、14 d)，每個時間點為6只。

1.2.2大鼠ICH模型的建立 參照文獻〔6,7〕報道的方法，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(350 mg/kg)，固定于大腦立體定位儀上，于前囟前0.2 mm中線向左側旁3 mm處鉆一直徑約為1 mm的小孔，斷尾取血，用微量注射器沿鉆孔方向將50 μl的抗凝血緩慢注入左側尾狀核，留針10 min，之后緩慢退針，縫合頭皮。假手術組不注射自體血。大鼠出現明顯的神經系統病理體征，左側肢體失用性偏癱癥狀出現，以前肢為重，行走過程呈順時針向追尾狀，則為制備成功ICH模型〔8〕。

1.2.3中醫治療 高、中、低劑量藥物治療組大鼠分別以5、10、20 g/kg破血化瘀，填精補髓方劑灌胃治療，1次/d。陽性藥組大鼠以0.3 g/kg醒腦健神膠囊灌胃治療，1次/d。假手術組及模型組大鼠以10 ml/kg生理鹽水灌胃。對照組大鼠自由飲食飲水。

1.2.4神經功能評價 造模后1、3、7，14 d，使用Longa等〔9〕評分法評定大鼠神經功能。0 分：沒有神經功能缺損；1 分：左側前爪不能完全伸展；2 分：行走時，大鼠向左側轉圈；3 分：行走時，大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒；4 分：不能自發行走，有意識喪失。

1.2.5取材 造模后1，3，7及14 d，分別以10%水合氯醛過量麻醉大鼠，迅速斷頭開顱取腦，在冰盤上的培養皿(經DEPC處理)上分離右側腦組織，以注血針孔處為中心取腦組織約100 mg，置于凍存管，-80℃冰箱保存備用。

1.2.6大鼠腦水腫的測量 造模后3、7 d，把大鼠斷頭處死，取大腦，冠狀位切片，切成2 mm厚，用數碼相機拍照。使用病理圖像分析軟件(Image-Pro Plus)以冠狀位血腫最大切面與相應冠狀切面的面積比作為腦水腫的指標。

1.2.7大鼠大腦含水量的測定 采用干濕法測定大鼠大腦含水量。取大鼠2 mm厚冠狀位腦片，精確稱取腦組織濕質量，置于100℃～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重后，稱取干質量，腦組織含水量(%)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%〔10〕。

1.2.8反轉錄PCR檢測大鼠大腦黑質豆狀核中BDNF及其受體TrkB mRNA的表達水平 取大鼠大腦黑質組織100 mg置于DEPC水處理過的玻璃勻漿器中，加Trizol(Invitrogen，Carlsbad，USA)1 ml充分勻漿，室溫放置5 min；將組織勻漿轉移至EP管中，4℃下，12 000 r/min離心10 min；將上清液轉移至另一EP管中，每管加氯仿0.2 ml，室溫靜止2～3 min后，4℃，12 000 r/min離心15 min；將無色上層水相，轉移至另一潔凈的EP管中，加入等體積的異丙醇，上下輕輕搖勻，室溫下靜止10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；棄去上清液，每管加入75%冰乙醇1 ml，4℃，7 500 r/min離心5 min。去除上清液，室溫下干燥沉淀3～5 min，加入0.2 ml無RNase水溶解沉淀，制成組織總RNA溶液。RNA保存于50 μl無RNase滅菌用水中，-80℃保存。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，應用紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定RNA，A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0，表明RNA的純度高，可用于反轉錄PCR實驗。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。取0.2 ml PCR反應管，每管依次加入cDNA溶液2 μl，10×Taq酶緩沖液5 μl，dNTPs(10 mmol/L)2 μl，目的基因上、下游引物各10 μl，內參上、下游引物各5 μl，cDNA溶液5 μl，Taq酶3 μl，DEPC處理水3 μl，總反應體積50 μl。BDNF上游：GTC CAC GGA CAA GGC AAC TTG G;下游：ACC GGA CAT GTC CAC TGC AGT;擴增長度392 bp；TrkB上游：GAT GTT CCA GCC ACT GTGAAC C;下游：CCC AAG ACC AGC AAGCAT AAG C;擴增長度257 bp;GAPDH上游：ACCACAGTCCATGCCATCAC;下游：TCCACCACCCTGTTGCTGTA;擴增長度450 bp;GAPDH預變性94℃ 5 min,變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，后延伸72℃ 10 min，循環次數35；BDNF預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火58℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，后延伸72℃ 10 min，循環次數35；TrkB預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火56℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，后延伸72℃ 10 min，循環次數35。采用常規方法，用TAE緩沖液，制備含溴乙啶(終濃度為1 μg/μl)的1.5%瓊脂糖，每道加樣10 μl，室溫下100V恒壓電泳25 min。電泳結束后，取5 μl反應產物做2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析儀(杭州天能生物科技有限公司)采集圖像，用凝膠成像分析系統分析平均吸光度值。

1.2.9免疫組織化學染色觀察大鼠腦組織中的表達 將10%甲醛固定的大鼠腦采用常規石蠟包埋、切片，制成2 mm切片，分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色。大鼠腦組織切片以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，枸櫞酸緩沖液熱修復 30 min，室溫自然冷卻；3% H2O2室溫孵育5 min，以阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次；滴加一抗(1∶50～200)4℃過夜，PBS沖洗，5 min×3；滴加通用型IgG抗體-辣根過氧化物酶(HRP)(即用型)37℃孵育15 min，PBS 5 min×3；應用二氨聯苯氨(DAB)溶液顯色，蒸餾水沖洗、HE復染、充分水洗、酸乙醇分化、充分水洗、乙醇脫水、二甲苯透明、樹脂膠封片。陰性對照不加一抗。高倍鏡下觀察細胞染色情況，拍照記錄結果。應用圖像分析方法(motic image advanced 3.2，北京儀嘉林科技有限公司)測定灰度值。

2 結 果

2.1破血化瘀，填精補髓方劑改善ICH大鼠神經系統體征及神經功能 與假手術組相比，ICH大鼠出現明顯的神經系統病理體征，右側腦損傷后，左側肢體失用的偏癱癥狀，以前肢為重，行走過程呈順時針方向追尾狀，大鼠神經功能缺損評分明顯增加(P<0.01)；與模型組大鼠比較，以不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠上述癥狀明顯改善(P<0.01)，至第7天時，受試藥中、高劑量組大鼠神經系統體征基本恢復正常。見表1。

表1 破血化瘀，填精補髓法對腦出血大鼠神經功能缺損評分的影響

2.2破血化瘀，填精補髓方劑減少ICH大鼠吸收出血面積比 在連續給藥3 d后，陽性藥組與模型組大鼠比較，ICH面積比無顯著性差異(P>0.05)；受試藥低、中、高劑量組與模型組大鼠比較，ICH面積比均有顯著性差異(均P<0.05)；在連續給藥第7天后，受試藥三個劑量組與模型組大鼠比較ICH面積比均有顯著性差異(均P<0.01)，并表現出具有一定的時-量依賴關系。見表2。

2.3破血化瘀，填精補髓方劑減少ICH大鼠腦組織含水量 干濕法測定結果顯示，與假手術組大鼠比較，造模3 d后，模型組大鼠損傷腦區腦含水量明顯增加(P<0.01)。與模型組大鼠比較，造模3 d后陽性藥組及受試藥低、中、高劑量組大鼠腦含水量明顯降低(P<0.05)；但造模后7 d時各組大鼠腦含水量沒有顯著性差異(P>0.05)。見表3。

2.4破血化瘀，填精補髓方劑增加ICH大鼠血腫周圍組織BDNF，TrkB和VEGF表達 免疫組化染色顯示，與假手術組大鼠相比，ICH大鼠血腫周圍組織BDNF表達增加(P<0.05)；經不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠血腫周圍組織BDNF表達進一步增加(P<0.05)。見表4。

表2 破血化瘀，填精補髓法對各組大鼠出血面積比隨時間變化的比較

表3 破血化瘀，填精補髓方劑對ICH大鼠腦組織含水量的影響

表4 破血化瘀，填精補髓法對ICH大鼠腦血腫周圍組織BDNF表達(灰度值)的影響

免疫組化染色顯示，與假手術組大鼠相比，ICH大鼠血腫周圍組織TrkB表達增加(P<0.05)，而經不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠血腫周圍組織，TrkB表達進一步增加(P<0.05)。見表5。

免疫組化染色顯示，與假手術組大鼠相比，ICH大鼠血腫周圍組織VEGF表達增加(P<0.05);而經不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑或醒腦健神膠囊治療的大鼠血腫周圍組織VEGF表達進一步增加(P<0.05)。見表6。

表5 破血化瘀，填精補髓法對ICH大鼠腦血腫周圍組織TrkB表達(灰度值)的影響

表6 破血化瘀，填精補髓法對ICH大鼠腦血腫周圍組織VEGF表達(灰度值)的影響

2.5破血化瘀，填精補髓方劑增加ICH大鼠損傷腦區BDNF和TrkB mRNA表達 反轉錄PCR檢測結果顯示，與假手術組大鼠相比，造模后第7天，ICH大鼠損傷腦區BDNF和TrkB mRNA的表達明顯升高；而與模型組相比，不同劑量破血化瘀，填精補髓方劑均能明顯增加大鼠損傷腦區BDNF和TrkB mRNA表達，且受試藥中、高劑量組的效果更為顯著，但陽性藥物醒腦健神膠囊對大鼠損傷腦區BDNF和TrkB mRNA表達沒有明顯影響。

3 討 論

ICH后引起機體和腦組織局部產生一系列病理性反應，其中最重要的是局部腦血流量減少，腦內血腫，血腫分解產物(凝血酶)和腦組織直接損傷釋放的各種血管活性物質所致的腦水腫、顱內壓增高及遲發性的神經元損傷〔11〕，這些變化直接影響腦出血的預后。迄今為止尚缺乏確切有效的治療方法，如何降低患者的病死率及致殘率是目前急需解決的難題。

BDNF是一類多功能的多肽生長因子，廣泛存在于腦內各組織，以大腦皮質、海馬、紋狀體分布最為豐富。生理情況下，BDNF在中樞神經系統正常發育過程中，可調節神經元的存活、分化和軸突導向；病理情況下，BDNF參與了腦損傷的保護過程〔12,13〕。在腦缺血損傷后，早期即有BDNF蛋白及mRNA的表達水平明顯升高，特別是在缺血相對耐受的齒狀回顆粒細胞中，出現BDNF蛋白及受體TrkB的持續表達，提示這些細胞可能通過產生BDNF，作為一種內源性的神經保護劑而抵抗缺血、缺氧，從而對局部缺血、缺氧的神經元發揮潛在的保護作用。Cheng等〔14〕發現在缺血、缺氧性腦損傷后腦室內給予BDNF有顯著的神經保護作用，且早期應用效果更佳，并可上調TrkB受體，阻斷胞內損傷因子對蛋白激酶C的失活，特異性防止神經細胞缺血后的死亡〔15〕。實驗發現，在連續給受試藥第3天時，BDNF在血腫周圍表達明顯增加，于第7天達高峰，推測其一方面，可能為受試藥在腦內促進在皮質、海馬及血腫周圍的神經元或膠質細胞中合成，誘導BDNF蛋白表達及分泌增加，保護受損神經元；另一方面，受試藥通過提高內源性BDGF表達水平，與特異受體相結合，啟動細胞內信號傳導途徑，產生相應的效應分子，調節神經元和周圍結構、促進神經元存活、軸突再生而大鼠神經系統病理體征具有明顯改善作用〔16〕。經臨床研究證明了該受試藥可改善出血性腦卒中的中醫證候、減輕患者神經功能缺損程度、 提高患者的生活能力和生活質量，其有效率達到84.00%〔6〕。

另有研究表明，BDNF mRNA則主要表達于神經元，部分表達于血腫周圍的活化小膠質細胞〔17〕。傳統觀念認為，BDNF是一種靶源性的神經生長因子，即BDNF在靶組織(如皮質、海馬等)內合成、分泌，作用于投射纖維終末的受體TrkB，形成配體-受體復合物，經逆行轉運到神經元的胞體而發揮神經元存活。近來研究發現BDNF以類似出胞的形式分泌到細胞外基質中而對臨近的神經細胞發揮營養作用〔18〕。本實驗結果推測受試藥可能通過促進靶組織皮質、海馬等處神經元或膠質細胞內BNDF mRNA的表達。而BDNF mRNA表達的增高又可促進其基因表達產物-BDNF蛋白的合成與分泌,然后通過逆行運輸的方式到達受損區域，從而發揮神經營養作用，促進受損神經元的存活。

TrkB是BONF的高親和力受體，主要分布于大鼠腦內包括大腦皮質、海馬齒狀回、黑質-紋狀體、下丘腦、小腦、中腦頂蓋區和腦干等，其陽性顆粒不僅分布于神經元胞體，而且延續到纖維，其中以海馬齒狀回和皮質的含量最高，成為腦內分布最為廣泛〔19〕。TrkB免疫組織化學染色結果表明，其作用機制可能BDNF與其特異性受體TrkB結合對突觸可塑性和神經元具有保護作用。

VEGF是近年來發現的一種具有肝素結合活性的生長因子，為同性二聚體蛋白化合物，高度特異地作用于血管內皮細胞，刺激血管內皮細胞增殖，誘導體內新生血管形成〔20〕。正常情況下表達水平很低，病理條件下，可在其血管內皮中檢測到受體的高表達。眾多實驗已證實，腦缺血后VEGF的表達上調：主要是通過PKC途徑，通過促進內皮細胞增生，在缺血區誘導大量新生血管形成，改善微循環，增加受累腦組織再灌注及供氧量，促進受損腦組織修復，加強神經元的營養和神經元功能的恢復〔21〕。有關VEGF在出血性腦血管病的病理機制中的作用，國內外的研究多集中在VEGF對血腦屏障、腦水腫、腦損傷及腦保護等方面的影響。一部分學者認為VEGF可能參與ICH后血腦屏障的破壞，促進腦水腫的形成〔22〕并加劇缺血性神經元的損傷〔23〕。另一部分學者則認為VEGF參與了ICH后血腦屏障的保護、減輕腦水腫及腦損傷，有神經保護作用〔24〕。研究結果提示受試藥具有明顯的增加了損傷腦區VEGF陽性細胞數量。

綜上，破血化瘀、填精補髓法治療大鼠急性期ICH，可明顯改善神經功能缺失癥狀，減輕腦血腫，促進腦水腫的吸收。其機制可能與促進BDNF表達，開通BDNF-TrkB通路，而達到神經元細胞的保護及修復有關。

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