大豆異黃酮對AD大鼠海馬CaM-CaMPK信號轉導通路相關蛋白的影響

王 艷 汪遠金 蔡 標 劉長安 宋 睿 汪天明

(安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038)

大豆異黃酮(SIF)是大豆在生長過程中形成的一類次生代謝產物，其所含的三種苷元(三羥異黃酮、二羥異黃酮和黃豆黃素)與 17β-雌二醇的結構非常相似〔1〕，與雌激素受體有較高的親和力，具有類雌激素作用，被譽為“天然雌激素”,可改善與雌激素水平低下相關的疾病如骨質疏松等〔2〕。阿爾茨海默病(AD)是一種進行性、致死性的神經退行性疾病，臨床表現主要為認知和記憶功能不斷惡化，并伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。本實驗以Aβ25～35誘導建立AD大鼠模型，給予其不同劑量SIF后，觀察大鼠海馬組織鈣調蛋白(CaM)、鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaMPK)含量和Ras蛋白表達的變化，研究SIF對AD大鼠海馬CaM-CaMPK信號轉導通路的影響，探討SIF治療AD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 10月齡雌性Wistar大鼠50只，體重250～350 g，購自河南省實驗動物中心，合格證號SCXK(豫)093273。

1.2藥物、試劑及儀器 SIF(84%純度，華北制藥股份有限公司，批號 060104)；戊酸雌二醇片(DELPHARM Lille S.A.S，批號 142A)；Aβ25～35(Sigma，批號 108K4794)；CaM測定試劑盒(上海活樂生物科技有限公司，批號 20100569)；CaMPK測定試劑盒(上海活樂生物科技有限公司，批號 20100528)；Ras(一抗，北京博奧森生物科技有限公司，批號 K0614)。NS型腦立體定位儀(日本)；Multiskan MK2型酶標儀(Labsystem)；80i型光學顯微鏡(Nikon)；JeDa 801D圖像分析系統(江蘇捷達)。

1.3方法

1.3.1分組 大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、模型組、SIF高劑量組(SIF-H，9 mg/kg)、SIF低劑量組(SIF-L，3 mg/kg)、雌激素陽性對照組(戊酸雌二醇組，0.4 mg/kg)。

1.3.2動物模型的建立〔3〕10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射將大鼠麻醉后，固定于腦立體定位儀上，從頭頂部正中切口暴露前囟，以前囟為原點，向后4.4 mm、旁開2.2 mm為穿刺點，鉆孔穿顱。自腦表面進針3.0 mm至雙側海馬，將Aβ25～351 μl(10 μg)用微量注射器5 min緩慢注入，留針5 min，以使Aβ25～35充分浸潤局部組織。假手術組注射等量的生理鹽水。退針后縫合傷口，術后腹腔注射青霉素鈉預防感染，連續3 d，常規飼養。

1.3.3治療 術后3 d給予藥物治療。SIF用0.5%羧甲基纖維素鈉配成濃度0.9 mg/ml(高劑量組)、0.3 mg/ml(低劑量組)的混懸液，戊酸雌二醇用蒸餾水配制成濃度為0.04 mg/ml的溶液。SIF高、低劑量組和雌激素陽性對照組稱重后灌胃給藥(0.1 ml/kg)，模型組給予等量的0.5%羧甲基纖維素鈉，連續21 d。假手術組常規飼養。

1.3.4取材 21 d后，用10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，斷頭處死，在生理鹽水冰面上快速取腦，用4℃生理鹽水沖洗腦組織上的血液，分離海馬組織，一部分稱重后置入9倍預冷的生理鹽水內(1∶10)，冰浴中勻漿10次，3 000 r/min離心10 min，制備成10%腦組織勻漿。-80℃冰箱凍存，待測CaM和CaMPK含量。另一部分置于4%的多聚甲醛中固定，待觀察大鼠海馬組織Ras蛋白表達。

1.3.5Morris水迷宮成績檢測SIF對AD大鼠學習記憶的影響 術后13 d進行Morris水迷宮訓練,上、下午各1次,共6 d。訓練時選擇一個固定入水點,將大鼠面向池壁放入水中,觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內未尋找到平臺,需人為將其引至平臺，這時潛伏期記錄為120 s。撤除平臺,記錄120 s內大鼠在池中的游泳時間、穿過平臺所在位置的次數以及在平臺象限的游泳時間。訓練期間外參照物固定，水溫保持在(26±1)℃。數據采集和處理由Morris迷宮圖像自動監視處理系統完成。6 d后將各組成績進行比較。

1.3.6ELISA法檢測CaM、CaMPK含量 按照試劑盒說明書測定CaM、CaMPK含量，經包被、加樣、加酶標抗體、加底物液顯色后終止反應。結果判定：酶標儀設定波長450 nm，讀取各孔的OD值；以OD值為縱坐標，以標準品的濃度為橫坐標，繪制曲線圖；根據樣品的OD值查找對應的濃度范圍。

1.3.7免疫組化SP法檢測大鼠海馬組織Ras蛋白的表達 將固定后的腦組織進行常規脫水、透明、包埋、切片、脫蠟至水。0.01 mol/L TBS溶液(pH6.0)微波熱修復抗原；3% H2O2溶液孵育10 min；滴加正常山羊血清封閉液；滴加一抗，4℃過夜；室溫復溫10 min；滴加二抗工作液，37℃水浴箱孵育30 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液；DAB顯色，蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木精輕度復染；脫水，透明，封片。每張切片在顯微鏡下隨機取4個高倍視野觀察海馬CA1、CA2、CA3、CA4區域并拍照。神經元胞質及突起內染棕黃色為Ras蛋白陽性表達，采用JeDa 801D圖像分析系統統計陽性表達的平均光密度值(MOD)。

2 結 果

2.1SIF對AD大鼠Morris水迷宮成績的影響 與假手術組相比，模型組逃避潛伏期顯著延長，游泳時間百分比顯著升高，穿過平臺次數顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，SIF-H組和雌激素陽性對照組逃避潛伏期顯著縮短、游泳時間百分比顯著升高、穿過平臺次數顯著增加(P<0.01)，SIF-L組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01)、游泳時間百分比明顯升高、穿過平臺次數明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.2SIF對AD大鼠海馬CaM、CaMPK含量的影響 與假手術組比較，模型組海馬組織CaM和CaMPK含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，SIF-H組海馬組織CaM和CaMPK含量顯著降低(P<0.01)，SIF-L組海馬組織CaM和CaMPK含量明顯降低(P<0.05)，雌激素組海馬組織CaMPK含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果

表2 各組AD大鼠海馬CaM、CaMPK含量的比較

2.3SIF對AD大鼠海馬Ras蛋白表達的影響 見圖1。假手術組大鼠海馬組織Ras蛋白未見明顯表達(0.168±0.024)；模型組大鼠海馬組織Ras蛋白呈強陽性表達(0.257±0.024)；SIF-H組大鼠海馬組織Ras蛋白呈輕度表達(0.188±0.015)；SIF-L組大鼠海馬組織Ras蛋白呈輕、中度表達(0.195±0.206)；雌激素組大鼠海馬組織Ras蛋白呈輕度表達(0.186±0.032)。

圖1 各組大鼠海馬組織Ras蛋白的表達(免疫組化SP法，×400)

3 討 論

AD臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化，并有各種神經精神癥狀和行為障礙。病理改變主要為皮質彌漫性萎縮，神經元大量減少，并可見老年斑、神經原纖維纏結等病變〔4〕。AD的發病與神經元鈣穩態失調有關，這種失調發生于神經元、星型膠質、少突膠質和小膠質細胞中，直接導致了神經元結構和功能的失常及細胞的壞死〔5〕。CaM是細胞中的一種重要的多功能蛋白，它可以激活40多種酶或者通道，參與許多生物功能。CaM 不僅參與了神經元和星形膠質細胞的信號級聯放大系統，參與了突觸可塑性、細胞的分化和增生，還在長時程增強效應和學習記憶中起重要作用〔6〕。Ras蛋白是ras基因表達產物，是一種GTP結合蛋白，Ras蛋白的活性狀態對細胞的生長、分化、細胞骨架、蛋白質運輸和分泌等都具有影響。AD發病時神經元內Ca2+超載，Ca2+與特異性的Ca2+結合蛋白相互作用發揮功能，其中以CaM為主，一個CaM 分子可與4個Ca2+結合。當CaM與Ca2+結合,即成為有活性的鈣-鈣調蛋白復合物(Ca2+/CaM)。Ca2+/CaM激活CaMPK，CaMPK再激活Ras蛋白，通過啟動相應的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路發揮作用〔7〕，最終導致神經元損傷/抗損傷平衡的失調而引起細胞死亡,引起記憶功能障礙。

臨床研究發現絕經后婦女AD發病率明顯增高，且認知功能障礙比男性患者重，雌激素替代療法可以降低AD的發病率，改善記憶減退的癥狀〔8〕。雌激素可減少Aβ在腦內沉積〔9〕，維持細胞內Ca2+的平衡，緩解神經元退變的進程，促進腦內神經細胞軸突、樹突的生長和突觸的形成〔10〕，并能促進星形膠質細胞發育，支持神經元功能，對損傷的腦細胞有促進修復的作用,從而減輕AD的病理損傷。被譽為“天然雌激素”的SIF可改善AD大鼠的學習記憶能力，其作用機制可能與減少AD動物海馬神經元的丟失〔11〕，具有抗氧化作用〔12〕，減少tau蛋白磷酸化〔13〕等因素有關，我們之前的研究也發現SIF可減少AD大鼠海馬載脂蛋白E4(Apo-E4)的含量〔14〕、影響No-cGMP信號轉導系統〔15〕。

本實驗結果表明SIF可能通過降低AD大鼠海馬CaM-CAMPK信號轉導通路相關蛋白的含量或表達，減少神經元鈣穩態失調，從而起到治療AD的作用。關于SIF治療AD的機制有待于進一步研究。

4 參考文獻

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