氫化珊瑚鈣對衰老小鼠的抗氧化作用的影響

曹燁駿 殷文哲 及川胤昭 叢峰松

(上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240)

最近一些關于缺血再灌注的研究證實了氫氣是一種良好的抗氧化劑〔1～3〕。腦缺血再灌注損傷是因為需氧細胞代謝過程中產生的超氧自由基具有毒害效應，可使神經細胞膜結構破壞，從而引起神經元凋亡和腦組織的損傷〔4，5〕。根據研究，氫分子能夠顯著減少氧化壓力，從而抑制缺血再灌注引起的腦損傷。另有研究研究表明〔6～8〕，氫氣對于小腸、心臟及腎臟缺血再灌注損傷均有明顯的治療作用。氧化珊瑚鈣(CCH)是采用固態氫化技術生產的一種負氫離子(H-)粉末，遇水會緩慢釋放出氫。日本的Taneaki Oikawa等人發現給小鼠喂食氫化珊瑚鈣，可以增加小鼠大腦海馬內源性抗氧化能力〔9〕。本研究通過小鼠飼養實驗，應用D-半乳糖構建小鼠衰老模型，測定CCH對血清、腦組織和肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(T-AOC)以及Na+-K+-ATPase的影響，從而了解其抗氧化作用及其機制。

1 材料與方法

1.1動物 昆明小鼠18只，體重(20±2)g，6周齡，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(滬)2003-0002。

1.2實驗條件 上海交通大學閔行校區藥學院動物飼養間，室溫(24±2)℃，濕度(70±5)%，分每籠8只飼養，飼料由上海仕林生物科技有限公司提供。

1.3實驗試劑 CCH由日本HIC公司制造，上海全人生物科技有限公司提供；D-半乳糖(Sigma)；考馬斯亮藍R-250染色液，脫色液；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；T-AOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)；GSH-PX試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Na+-K+-ATPase試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4方法

1.4.1分組、灌胃及造模 小鼠購入試養2 d后，將18只小鼠隨機分為3組：對照組、模型組、CCH組，各6只。各組均采用灌胃途徑投入。灌胃30 d，灌胃體積0.2 ml/d。對照組及模型組予生理鹽水灌胃；CCH組將CCH以蒸餾水配成1 mg/ml溶液，混勻，給予灌胃(現配現用)。每天灌胃后1 h，模型組及CCH組將D-半乳糖以蒸餾水配成10 mg/ml溶液，腹腔注射0.2 ml，建立小鼠衰老模型〔10〕。

1.4.2取樣及數據測定 灌胃30 d后對小鼠進行解剖。用摘眼球法取小鼠全血，放入5 ml離心管中，靜置2 h后，然后放入高速離心機中25 000 r/min離心3 min，取上清，再重復一次此操作后，取上清得到血清，放入離心管中待用。另取小鼠的腦和肝臟，置于生理鹽水中，洗凈表面殘留血液，放入凍存管中，在液氮中保存。SOD、MDA、T-AOC、GSH-PX、Na+-K+-ATPase的測定分別按照對應試劑盒說明書操作，蛋白質的測定用考馬斯亮藍法。

1.5統計學處理 采用SPSS11.0軟件行方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1CCH對小鼠血清的影響 與對照組比較，注射D-半乳糖能夠顯著降低血清及SOD活性，顯著提高血清MDA含量(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，CCH能夠顯著提高血清T-AOC、SOD活性及GSH-PX活性極顯著降低血清MDA含量(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2CCH對小鼠腦組織的影響 與對照組比較，注射D-半乳糖能夠顯著降低腦組織SOD活性及GSH-PX活性，顯著提高腦組織MDA含量(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，CCH能夠顯著提高腦組織總抗氧化能力、Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)及GSH-PX活性，顯著降低腦組織MDA含量(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 實驗小鼠血清SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性及T-AOC檢測結果

2.3CCH對小鼠肝組織的影響 與對照組比較，注射D-半乳糖能夠顯著降低肝組織FAOC、SOD活性、GSH-PX活性及Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)。與模型組比較，CCH能夠顯著提高肝組織FAOC、SOD活性及GSH-PX活性，顯著降低肝組織MDA(P<0.01，P<0.05)。見表3。

表2 實驗小鼠腦組織SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性、Na+-K+-ATPase活性及T-AOC檢測結果

表3 實驗小鼠肝組織SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性、Na+-K+-ATPase活性及T-AOC檢測結果

3 討 論

D-半乳糖衰老模型是一種利用連續注射D-半乳糖，造成動物糖代謝紊亂的衰老模型。用D-半乳糖注射小鼠后，會出現多項生化指標的變化，包括SOD、GSH-PX活性及總抗氧化能力的降低和MDA含量的上升，這與衰老造成的變化是相一致的，證明其實一種可靠的衰老模型〔10，11〕。

人體中氧自由基的產生是不可避免的，當氧自由基不斷增殖至清除不掉時就會損害機體，導致衰老。因此機體內形成了一套抗氧化防御體系，包括內源性抗氧化劑和抗氧化酶〔12〕。SOD是內源性超氧陰離子自由基清除劑，其活性高低可部分反映機體清除自由基的能力〔13〕。GSH-PX是生物體內廣泛存在的一類重要的催化過氧化氫分解的酶。GSH-PX可以促進過氧化氫與還原型谷胱甘肽(GSH)反應生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，阻止了H2O2源的OH·自由基的產生以及其觸發的膜質的過氧化〔14，15〕。而T-AOC代表體內酶性和非酶性抗氧化物的總體水平，可以反應機體的健康狀況，當一個人的總抗氧化能力降低時，易引起炎癥、免疫系統疾病〔16〕。 MDA含量的增加會使膜流動性降低，通透性增加，大量Ca2+激活一系列的蛋白水解酶，引起遲發性細胞死亡〔17〕。另外，當細胞內Na+-K+-ATPase活性降低，會導致大量Na+進入細胞內，使得鈉鈣離子交換出現反轉，胞內Ca2+超載，引起細胞死亡〔18〕。

CCH負氫離子(H-)粉末,是一種強還原劑，根據實驗結果我們可以推測其抗衰老機制可能有以下兩種機制：①負氫離子通過將自身攜帶的兩個電子轉移給活性氧自由基，直接清除活性氧自由基；②通過體內代謝途徑，負氫離子、氫氣或兩者共同作用激活機體的GSH-PX和SOD等多種內源性抗氧化酶，使其活性提高，促進氧自由基被還原。

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