紫草萘醌組分抑制移植性肝癌新生血管的形成

閆光志 艾郁蔥 劉力華

(吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130012)

紫草為中國藥典收載的傳統(tǒng)中草藥。萘醌類色素為其主要有效成分；具有抗炎、抗腫瘤、保肝和免疫調節(jié)、抗病毒等作用〔1〕。本研究旨在探究紫草萘醌類化合物抑制腫瘤新生血管形成的作用。

1 材料與方法

1.1動物 50只雄性昆明小鼠購于吉林大學動物部。

1.2試劑 凝血第Ⅷ因子相關抗原(FⅧRAg)和平滑肌肌動蛋白α (α-SMA)單克隆抗體均為DAKO公司產品。紫草萘醌類提取物由吉林省腫瘤防治研究所提取制備成為水溶制劑(命名LE)。紫草素含量與標準品對比，用RPMI1640培養(yǎng)液配制為所需濃度。

1.3腫瘤體積測量 將50只小鼠隨機分為五組,每組10只。每只小鼠的左腋窩皮下注射肝癌細胞株(Hep-A-22)細胞。皮下接種腫瘤24 h后開始給藥。陽性對照組5-氟尿嘧啶(5-FU)腹腔注射，20 mg/kg；微乳液(LE)灌胃，劑量2.5、5.0和10.0 mg/kg。陰性對照組予以相同容積的溶劑灌胃，連用7 d。次日處死小鼠手術剝離取出腫瘤結節(jié)并稱量瘤體重量。實驗重復3次。

1.4微血管密度(MVD)測定 采用LSAB免疫組織化學染色。FⅧRAg和α-SMA單克隆抗體的工作濃度是1∶300。結果以在腫瘤血管內皮細胞和周細胞胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性。α-SMA染色的組織切片中,首先在100倍視野下隨機選擇血管密度高5個區(qū)和血管密度低5個區(qū)作為計數(shù)部位,最后在400倍視野下對應計數(shù)血管個數(shù)及胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒的血管周細胞數(shù),殘存血管不做計數(shù),然后計算單位視野(400倍)平均血管數(shù),即間質MVD。MVD的計算按Weidner報道的方法進行:先在40倍光鏡下找到癌巢周圍間質血管密集區(qū),然后在200倍的光鏡下計數(shù)上述4個不同區(qū)域的血管數(shù),取其平均值為血管密度。

1.5統(tǒng)計學方法 兩組腫瘤體積及MVD的比較應用t檢驗;VEGF的表達應用Ridit檢驗 。

2 結 果

2.1LE抑制Hep-A-22體內增殖 LE對可移植性肝癌的體內增殖具有抑制作用，三次實驗結果顯示皮下腫瘤的體積均明顯小于陰性對照組(P<0.01)。見表1。

2.2LE抑制腫瘤組織新生血管形成 皮下接種Hep-A-22 7 d后，免疫組化染色腫瘤組織的微血管。血小板FⅧRAg的免疫組化染色結果可見陰性對照組腫瘤組織中有大量新生微小血管形成。LE給藥小鼠皮下腫瘤體積小，F(xiàn)ⅧRAg免疫組化染色顯示陽性微血管明顯稀少，提示對新生血管形成的抑制作用。見圖1。

表1 LE抑制腫瘤Hep-A-22的體內增殖及對新生血管形成的影響

圖1 腫瘤新生血管形成及LE的抑制作用(×100)

2.3腫瘤新生血管分析 如表1所以，應用LE或5-FU，腫瘤體積明顯比對照組小，5-FU的抑制率高達50%。LE的抑瘤作用呈劑量依賴關系，差異顯著(P<0.05)。LE的最小劑量即2.5 mg·kg-1·d-1和5-FU給藥對腫瘤組織MVD表現(xiàn)相近程度的下調作用，均超過50%。而LE 10.0 mg/kg的MVD抑制超過70%，說明LE與5-FU都降低腫瘤組織的MVD；而LE的此種作用更為明顯。因此，新生血管形成的抑制是LE體內抑制Hep-A22腫瘤生長的重要原因。

3 討 論

LE抗腫瘤機制研究多集中在其誘導凋亡方面〔2～6〕,而對腫瘤體內血管生成的報告較少〔7〕。由于肝癌血管結構特殊,血供豐富,抑制腫瘤血管生成對治療肝癌更具有重要意義。腫瘤的MVD被認為是能反映腫瘤血管生成的一個指標,它不僅與腫瘤細胞的營養(yǎng)和供氧有關,而且也反映腫瘤的浸潤和轉移能力。腫瘤血管的啟動是由腫瘤細胞分泌的促內皮細胞增殖和遷移的多種生長因子所誘發(fā),如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化生長因子α(PDGFα)等,其中以VEGF及bFGF在實體瘤的生長和轉移中起重要作用。在眾多研究中,VEGF已被認為與腫瘤的浸潤轉移有關,抑制VEGF的活性或減少其受體(KDR)均能明顯抑制實驗性腫瘤的生長和轉移。

Folkman等〔8〕提出，腫瘤生長和轉移依賴新生血管形成，經過近幾十年研究，這一觀點已被普遍接受，腫瘤與血管形成之間的相互作用機制也漸明確〔7〕。基于這一理論，抑制和破壞腫瘤新生血管阻斷腫瘤血供，導致腫瘤細胞壞死和阻斷轉移，可能成為治療腫瘤的新策略。腫瘤血管生成的機制不同于生理條件下血管生成，也不同于胚胎時期的血管生成。其特點既有癌細胞分裂增殖因素，也有局部炎癥和新生血管形成的改變。本研究顯示LE的最主要抗癌活性仍然是對癌細胞生長及其功能的抑制。這是因為最大給藥劑量即10 mg·kg-1·d-1，腫瘤體積比對照低50%，而MVD的減少只有30%。這說明紫草萘醌類化合物對腫瘤細胞的直接抑制是導致瘤塊膨脹減速的第一要素。而MVD的減少則是紫草萘醌類化合物的間接作用；減少腫瘤細胞VEGF的表達為其機制之一。事實上，新生血管形成的機制可能相當復雜。Furuya等〔9〕認為，脊椎動物胚胎發(fā)育和分化過程中，新生血管形成不可或缺。而對于成年人來說，許多生理或病理狀態(tài)，例如創(chuàng)傷修復、代謝疾病、炎癥、心臟血管疾病以及腫瘤進展都有新生血管形成參與。現(xiàn)在已經發(fā)展了一些與之相關的治療技術，例如調節(jié)參與新生血管作用之細胞因子可以抑制腫瘤進展。這些治療技術中，一部分已經進入臨床前研究階段。然而腫瘤新生血管形成過程非常復雜，不同腫瘤有其獨特的表現(xiàn)。組織特異性、新生血管微環(huán)境以及腫瘤分化程度等因素都與之有關；甚至宿主免疫性都可能在腫瘤新生血管形成過程起一定作用。因此要想正確認識并掌握有關的治療方法，不但需要了解新生血管形成的一般原理，而且需要了解各種疾病特異性的事件。后者涉及內皮性前體細胞、腫瘤血管模擬、瘤性來源內皮細胞和周細胞的分子標志以及血管形成相關的細胞因子等問題。不可否認，腫瘤細胞的旁分泌效應，例如本文檢查的VEGF表達，在腫瘤新生血管形成過程中是非常重要的事件；而Furuya等〔9〕提到的宿主免疫性，即癌細胞微環(huán)境中的炎癥反應對微血管形成也具有刺激作用。小鼠可移植性肝癌組織切片的免疫組化染色證明：LE不僅抑制肝癌細胞的原位生長，也抑制癌細胞分泌VEGF，從而明顯抑制接種局部肝癌組織內新生微血管的形成。

4 參考文獻

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3Wu Z，Wu L，Li L，etal.p53-mediated cell cycle arrest and apoptosis induced by shikonin via a caspase-9-dependent mechanism in human malignant melanoma A375-s2 cells〔J〕.J Pharmacol Sci，2004；94(2):166-76.

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7劉小平，宋少柏，徐文通，等.結直腸腫瘤微血管計數(shù)及血管內皮細胞生長因子表達〔J〕.中華腫瘤雜志，1999；21(6):430.

8Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent 〔J〕？J Natl Cancer Inst，1990；82(1):4-6.

9Furuya M，Nishiyama M，Kasuya Y,etal.Pathophysiology of tumor neovascularization〔J〕.Vasc Health Risk Manag，2005;1(4)：277-90.