烏司他丁對膿毒癥肺損傷大鼠HO-1表達的影響及保護作用

趙 利 程青虹 曾建瓊 何永來 張忠雙 張海俊

(石河子大學醫學院第一附屬醫院ICU，新疆 石河子 832008)

膿毒癥發生率高、病死率高，成為重癥監護病房內非心臟病人死亡的主要原因〔1，2〕。肺組織有其防御機制，能夠緩解或抑制炎癥反應所致的肺損傷，其中血紅素加氧酶(HO)是組織細胞保護酶和抗氧化劑，能夠對內毒素誘導的急性肺損傷動物模型起保護作用，臨床上以HO-1的表達量作為組織氧化應激水平的重要參考。本研究觀察烏司他丁(UTI)對膿毒癥早期肺損傷的保護作用以及治療后肺組織中HO-1表達的變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 120只雄性Wistar大鼠，體質量170～240 g，7～10周齡〔合格證號No.0014065,許可證號SYXK(粵),2003-0001〕。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2實驗試劑 UTI注射液(天普洛安)：廣東天普生化醫藥股份有限公司，國藥準字H20040505，2011-11-08。氯化鈉注射液：中國大冢制藥有限公司，國藥準字H12020010，2010-09-30。10%水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司，國藥準字H37022673。其他試劑均為國產分析純產品。

1.3方法

1.3.1分組 選取120只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、膿毒癥組和UTI組各40只。膿毒癥組和UTI組采用盲腸結扎穿孔法(CLP)建模，假手術組，開腹后不做處理，僅縫合。

1.3.2建模 實驗前禁食12 h。給藥前，采用10%水合氯醛生理鹽水0.3 ml/100 g行舌靜脈注射進行全身麻醉。麻醉后，常規消毒皮膚，在無菌條件下開腹，作長為2 cm的切口，將盲腸移出腹腔，用絲線于回盲瓣和盲腸末端1/2處結扎盲腸根部。用9號注射針頭于盲腸端選取相距3 mm的點穿刺3處，在穿刺孔處輕微擠出糞渣1滴后逐層縫合腹腔，強力碘消毒包扎傷口，防止手術切口感染。術后給予大鼠皮下注射5 ml/100 g生理鹽水補充術中體液流失。觀察大鼠的存活情況，以72 h死亡率70%～80%作為理想的膿毒癥模型。UTI組：大鼠術后0、12、24 h給予舌下靜脈注射UTI 50 000 U/kg；假手術組和膿毒癥組在相同的時間點注射等量生理鹽水；各組給藥后，于6、12、24 h處死大鼠。

1.4考察指標 (1)采用蘇木素-伊紅(HE)染色法，取肺組織觀察其病理變化；采用HE將肺組織石蠟切片染色1.5 min后自來水沖洗1 min去除多余色素，用1%鹽酸乙醇分化7 s后自來水沖洗10 min，HE復染2 min，接著分別用70%、80%、90%、95%乙醇分化5 s，最后透明劑10 min。光學顯微鏡下觀察肺組織結構變化，并于圖像采集系統中隨機選取10個高倍(400×)視野圖片觀察結果。(2)Western 印跡法測定HO-1表達情況，以actin作為內參照，以actin灰度值比值即為HO-1蛋白相對表達量。(3)采用Realtime PCR法測定HO-1 mRNA水平變化。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后掃描，用SD2.0軟件分析其Ct值，計算各標本平均Ct值，Ct=HO-1 Ct值-actin Ct值(Ct值越低，目的基因的相對表達量越高)，計算標準化后2-Ct值表示mRNA相對表達量。

2 結 果

2.1肺組織病理變化 術后6、12、24 h不同時間點，膿毒癥組較假手術組在肺出血、肺水腫、肺泡間隔、炎性細胞浸潤等病理上，變化越來越顯著。而經過UTI作用，UTI組其肺組織病理變化較膿毒癥組明顯減輕。見圖1。

2.2Western 印跡法觀察肺組織HO-1蛋白 術后6、12、24 h各時間點HO-1蛋白表達膿毒癥組較假手術組均增多，于12 h和24 h UTI組較膿毒癥組表達減少(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3Realtime PCR法觀察肺組織HO-1水平變化 術后6、12、24 h各時間點UTI組、膿毒癥組HO-1 mRNA的表達均多于假手術組；術后12、24 h，UTI組HO-1mRNA水平明顯低于膿毒癥組(P<0.05)。見圖3。

圖1 肺組織病理變化(HE染色,×200)

表1 各組在不同時間點HO-1蛋白表達

圖2 肺組織HO-1蛋白的表達

圖3 HO-1 mRNA水平變化

3 討 論

CLP建模是有效模擬與臨床相關的膿毒癥模型的有效方法，可模擬出臨床患者的肺內病理改變以及內源性多細菌感染〔4〕。膿毒癥是全身的炎癥反應，常見于危重術后并發癥，甚至可致危重患者死亡〔5〕。HO是血紅素分解代謝過程中的限速酶，因為環境、各式細胞壓力的催化或其他結構無關的藥物等因素催化，HO-1的表達量會有所增加。此外，若有物理或者化學性的刺激，HO-1基因會因組織和細胞的誘導發生編碼、轉錄，從而導致HO-1蛋白水平升高。結合近年來的研究〔6〕，對HO-1抵抗細菌性膿毒癥的機制有所發現。現有研究〔7,8〕表明，HO-1在肺缺血再灌肺損傷、呼吸機相關性肺損傷的模型中，其表達均有上升，對肺靶器官有保護作用。在本實驗中，觀察到假手術組肺組織結構完整，未出現肺組織水腫、紅細胞浸潤和炎性細胞等，肺泡間隔也并無增厚。膿毒癥組肺組織結構不連貫，有間斷，可觀察到肺泡腔內有紅細胞和炎性細胞，出現肺泡間隔增厚以及肺組織腫脹。在術后6 h，UTI組存在上述病理變化，且病理水平一致，但隨著時間延長，UTI組較膿毒癥組明顯減輕，可推測UTI對膿毒癥早期肺損傷有保護作用。

此外，大量研究〔9〕表明，HO-1/膽紅素/CO共同組成了機體不可缺少的內源性保護系統，廣泛參與多種急慢性氧化應激損傷，在多種疾病中起重要作用。HO-1基因缺乏可導致心、肺、腎、腦等多種疾病的損失，增加死亡率，反之，人為調高HO-1表達可有效增強組織和細胞抗損傷的能力〔10〕。本結果顯示UTI能明顯提高肺損傷大鼠HO-1 mRNA和蛋白在肺組織中的表達，由此推測UTI是通過提高HO-1表達而發揮抗氧化損傷的作用，這也可能是UTI治療膿毒癥肺損傷的機制之一。

UTI系從人尿提取精制的糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑。能夠通過抑制胰蛋白酶等各種胰酶活性作用，改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，有效防止手術刺激引起的對內臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環狀態等〔11〕。其作用機制是通過抑制粒細胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶等的活性，從而促進酶降解〔12,13〕。UTI對腎臟、肝臟和肺的功能有保護作用〔14〕，現已廣泛應用于臨床上各種休克及大手術時的臟器功能保護，或者輔助治療急診嚴重膿毒癥患者〔15〕。結合本研究結果，UTI對膿毒癥肺損傷大鼠確有保護作用。

以往研究〔16〕中，常采用預先給藥以研究藥物對膿毒癥肺損傷的保護作用，即在建模前給藥，明顯該方法與臨床實際情況不符。臨床上都是在患者發病后采取措施，因此本研究從實際情況出發，在發病初期予以UTI處理，以更接近臨床狀況。本實驗的結果表明，肺組織中HO-1的產生可提示膿毒癥引起的肺損傷，氧化應激水平可通過UTI抑制炎癥因子而改善,間接上調HO-1的表達,為膿毒癥時對大鼠的肺損傷起保護作用。

4 參考文獻

1趙永禎,李春盛.急診膿毒癥病死率評分在急診膿毒癥患者中的應用〔J〕.中華急診醫學雜志,2011;20(8):797-802.

2Annane D,Bellissan E,Bollaert PE,etal. Corticosteroids in the treatment of severe sepsis and septic shock in adults：a systematic review〔J〕. JAMA,2009;301(22):2362-75.

3王桂禎，王 璽，林兆奮.盲腸結扎穿孔法膿毒癥大鼠的骨骼肌蛋白代謝規律研究〔J〕.外科理論與實踐，2012;17(6)：654-8.

4Snelgrove RJ.Pulmonary innate lymphoid cells regulate repair and remodeling after acute lung injury〔J〕.Expert Rev Anti Infect Ther,2012;10(3):281-4.

5馬春燕，陳 麗.氯胺酮對膿毒癥大鼠肺組織HO-1表達的影響〔J〕.中國醫療前沿，2011;6(22)：15-6.

6王 劍，卿國忠，楊少俊.烏司他丁對急性肺損傷大鼠肺組織HO-1表達的影響〔J〕.當代醫學，2012;18(25)：10-2.

7王 軍.烏司他丁對急性百草枯中毒肺損傷患者血清炎性因子水平的影響〔J〕.山東醫藥,2011;51(31):62-3.

8胡偉偉,趙文靜.大鼠血紅素加氧酶-1表達對呼吸機相關性肺損傷時SOD、MDA的影響〔J〕.徐州醫學院學報,2010;30(5):281-4.

9Ryter SW，Choi AM.Heme oxygenase-1/carbon monoxide：novel therapeutic strategies in critical care medicine〔J〕.Curr Drug Targets,2010;11(12)：1485-194.

10Nussler AK，Hao L，Knobeloch D，etal.Protective role of HO-1 for alcohol-dependent liver damage〔J〕.Dig Dis,2010;28(6)：792-8.

11雷 明.烏司他丁對重癥膿毒癥患者的療效和安全性分析〔J〕.白求恩軍醫學院學報,2012;10(4):299-300.

12安 宇,何敬遠,王義興,等.烏司他丁聯合血必凈治療重癥膿毒癥的研究〔J〕.現代生物醫學進展,2011;11(15):2898-900.

13劉淑紅，崔朝勃，王 晶，等.烏司他丁治療重癥肺炎的臨床研究〔J〕.中國急救醫學，2010;30(6)：508-11.

14蔡 毅，林建東.烏司他丁對膿毒癥臟器的保護作用〔J〕，醫學綜述，2010;16(2)：286-8.

15宋 維，歐陽艷紅，劉元稅，等.烏司他丁對急診膿毒癥患者的器官保護作用〔J〕.海南醫學，2011;22(23)：72-4.

16許 平,白慶梅.烏司他丁對急性肺損傷的保護作用〔J〕.中國現代藥物應用,2010;4(8):46.