黑龍江省露地西瓜細菌性果斑病病原菌的分離與鑒定1)

賈云鶴

(黑龍江省農業科學院園藝分院，哈爾濱150069)

西瓜細菌性果實腐斑病，又稱西瓜果斑病、果腐病(Bacterial Fruit Blotch，簡稱BFB)，是種傳細菌性病害。該病害的病原菌為燕麥食酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。該病害近年來由國外傳入中國，該病害發病、傳播迅速，危害嚴重。目前國內外尚沒有免疫品種，也缺乏特效的防治藥劑[1]。

近年來，黑龍江省西瓜主產區果斑病爆發嚴重。西瓜主產區雙城2009年、2010年的果斑病發病率達到70％以上，給瓜農造成了巨大的損失。針對這些情況，本試驗對黑龍江地區露地西瓜的果斑病病原菌進行分離、純化、鑒定，以期在下一步試驗中根據黑龍江省西瓜果斑病病原菌的特性，找出適合防治黑龍江省西瓜果斑病的有效方法。

1 材料與方法

從黑龍江省露地西瓜主產區哈爾濱、雙城、齊齊哈爾、牡丹江、佳木斯、大慶等地進行病樣采集。取樣部位為病瓜內表皮(西瓜皮白色的部分)。病原菌的分離、純化方法為平板劃線法。病原菌鑒定方法包括病原菌的致病性測定、病原菌的培養性狀觀察、顯微形態觀察及染色、PHB積累(類脂粒顆粒)、金氏B培養基(KBA)上熒光色素的產生、病原菌的生理生化測定(甲基紅試驗、V-P試驗、吲哚試驗)、寄主范圍測定。試驗方法參照方中達的《植病研究法》[2]和任欣正的《植物病原細菌的分類和鑒定》[3]。

病原菌對西瓜的致病性測定：將獲得的純培養菌株在30℃培養24～48h，制成108cfu/mL菌懸液，采用噴霧法將病原菌接種到健康無病西瓜苗上，28℃下保濕24～48h，記錄出現病癥的時間。接種10天之后無病癥視為無致病性。

病原菌的培養性狀觀察、顯微形態觀察及染色：觀察菌體形態、測定菌體大小。電鏡觀察菌體的顯微形態。對有致病性的菌株，按一般細菌學常規方法，30℃下培養24～48h后進行革蘭氏染色；

PHB積累(類脂粒顆粒)：按常規方法制成涂片后，用蘇丹黑(蘇丹黑B 0.3g；70％乙醇100mL)染10min，用水沖去染劑，再用二甲苯沖洗至涂片無色，然后用0.5％番紅水溶液復染1～2min，水洗，吸干后鏡檢。

金氏B培養基(KBA)上熒光色素的產生：將病原菌接在KBA培養基上,24～48h后在波長254nm的紫外燈下檢查熒光色素的產生。

病原菌的生理生化測定：甲基紅試驗、V-P試驗、吲哚試驗分別采用葡萄糖蛋白胨營養液試管、蛋白胨水培養基進行試驗。

寄主范圍測定：將30℃培養36h的菌株配成108cfu/mL的菌懸液采用噴霧法分別接種于健康的下列作物上：西瓜(Citrulli)、甜瓜(Cucumismelo)、黃瓜(Cucumissativus)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫蘆(Cucurbitapepo)、茄子(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicumfrutescens)、番茄(Lycopersiconesculentum)，共8種作物。接種后28℃下用塑料薄膜保濕48h，一周后觀察結果。

2 結果與分析

從黑龍江省各市縣18點采樣，分離出病原菌18份，病原菌的理化特性詳見表1。其中8份在接種試驗中對西瓜具有致病性，分別為采樣自哈爾濱市黑龍江省園藝分院的H-hrb-1、采樣自哈爾濱市黑龍江省紅旗農場的H-hrb-2、采樣自雙城市周家鎮的H-sc-1、采樣自雙城市三鄰村的H-sc-2、采樣自齊齊哈爾市富拉爾基區的H-qqhr-1、采樣自牡丹江市寧安縣的H-mdj-2、采樣自佳木斯市集賢縣的H-jms-1、采樣自大慶杜蒙縣的H-dq-1。

根據這8個菌株革蘭氏染色反應陰性；顯微形態為菌體桿狀，大小為(2～3)μm×0.5μm，單極生鞭毛；培養性狀為菌落突起，乳白色，大小為1～2mm；由此可以確定這8個菌株為食酸菌屬(Acidovorax)。

根據這8個菌株能積累PHB，在KBA培養基上不產生熒光色素，可以確定兩個菌株為燕麥食酸菌(Acidovoraxavenae)。

根據這8個菌株甲基紅和V-P反應陰性，不能產生吲哚，能寄生在西瓜上，可以確定這8個菌株為燕麥食酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。

這8個菌株的寄主范圍不盡相同，H-sc-1只在西瓜上發病，H-hrb-2只在西瓜和茄果類作物上發病。

表1 不同地點病原菌的理化特性

3 結論與討論

3.1 通過8個對西瓜具有致病性菌株的生理生化測定，可以確定黑龍江省西瓜主產區的露地西瓜細菌性果斑病病原菌為燕麥食酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。

3.2 通過對這8個菌株寄主范圍的測定，發現黑龍江省西瓜細菌性果斑病病原菌應該分兩個類型：H-sc-1只和H-hrb-2為一個類型，只侵染西瓜；其他菌株為一個類型，侵染包括西甜瓜在內多種葫蘆科作物和茄果類作物。這個結果和前人的研究相似：Walcott等人研究了Aac的分化現象[4]。他將世界各地56個菌株的DNA酶切處理后獲得的指紋圖譜進行了PFGE(脈沖電場凝膠電泳)，認為這些菌株的遺傳表形已經有了分化，可以分為24個單元型。這些單元型有可分為2組：1組中菌株的寄主包括多種瓜類作物，2組中菌株的寄主全部來自西瓜。

[1]Francisco C. Q. Carvalho,et al.Selection of watermelon genotypes for resistance to bacterial fruit blotch[J]. Euphytica 2013,2(190)：169-180.

[2]方中達.植病研究法[M]. 3版.中國農業出版社,1997：156-211.

[3]任欣正.植物病原細菌的分類和鑒定[M].北京:農業出版社,1992：29-39.

[4]Walcott R. R.,et al. Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp. Citrulli[J]. Phytopathology,2003,93:528-534.