微生物傳感器的發(fā)展和應(yīng)用

付 強(qiáng) 林初文 程立坤 陳 群

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.北京尚洋東方環(huán)境科技股份有限公司，中國 北京 100081)

微生物傳感器是使用微生物活細(xì)胞或細(xì)胞碎片作為敏感元件與電化學(xué)換能器來制備的生物傳感器。由于微生物傳感器的核心部分是具有生物活性的微生物細(xì)胞，與基于酶的生物傳感器相比，微生物傳感器不需要昂貴的純化過程，微生物在其數(shù)量、大小、繁殖、遺傳改造等方面均具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此可以滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)中快速簡(jiǎn)單、原位、低成本的要求。

1 微生物傳感器的發(fā)展簡(jiǎn)介

自1975年Devis 制成了第一支微生物傳感器以來，微生物傳感器研制的關(guān)鍵技術(shù)在于微生物的固定，傳統(tǒng)的生物材料固定方法包括物理吸附、共價(jià)鍵合、交聯(lián)到一定的載體基質(zhì)上或包埋于有機(jī)聚合物的基質(zhì)中，然而這些方法都存在穩(wěn)定期短和固定時(shí)引起微生物的損傷等缺陷，從而限制了微生物傳感器的發(fā)展。納米技術(shù)的出現(xiàn)提供另一種更好的固定方法，納米材料特有的光、電、磁、催化等性能，引起了凝聚態(tài)物理界、化學(xué)界及材料科學(xué)界的科學(xué)工作者的極大關(guān)注，這些進(jìn)步推動(dòng)了微生物傳感器的發(fā)展，現(xiàn)將微生物傳感器近年來應(yīng)用情況概述如下。

2 應(yīng)用

2.1 環(huán)境監(jiān)測(cè)

生化需氧量，簡(jiǎn)稱BOD，是水體中微生物分解有機(jī)物的過程中消耗水中溶解氧的量，以mg/L 表示。BOD 的測(cè)定對(duì)控制水體污染具有更重要的意義，傳統(tǒng)測(cè)定BOD 的方法需要5 天，用傳感器測(cè)定只需十幾至幾十分鐘，胡磊等[1]采用接枝二茂鐵為介體的微生物傳感器測(cè)量污水的BOD。結(jié)果表明，傳感器的線性范圍為2～300mg/L，能連續(xù)工作35 天，通過對(duì)實(shí)際水樣的測(cè)試表明，測(cè)得的BOD 與BOD5，具有良好的相關(guān)性。近年來，人們利用從污水和活性淤泥中富集的電化學(xué)活性微生物，構(gòu)建了多種有介體或無介體微生物燃料電池（MFC）生物傳感器，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MFC 電流（電壓）或電子庫侖量與電子供體的含量之間存在一定對(duì)應(yīng)關(guān)系，據(jù)此，科研人員研制出用于廢水BOD[2]以及有毒物質(zhì)[3]檢測(cè)的MFC 生物傳感器。

重金屬污染廣泛存在于環(huán)境中，它能通過生物富集作用對(duì)動(dòng)植物及人類產(chǎn)生危害。利用分析化學(xué)方法檢測(cè)重金屬離子對(duì)其生物危害缺乏直接檢定，生物傳感器檢測(cè)重金屬離子吸引了越來越多的研究興趣。發(fā)光微生物傳感器是目前生物毒性測(cè)試中研究最多的微生物傳感器之一。最常用的生物發(fā)光系統(tǒng)是用于水體毒性實(shí)驗(yàn)的Microtox 法評(píng)價(jià)。我國早在1995年就頒布了水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但這些方法需要預(yù)先配制培養(yǎng)基、復(fù)蘇菌種等復(fù)雜過程，李書鉞[4]以明亮發(fā)光桿菌作為指示生物，研制的傳感器將可同時(shí)分析Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性作用，該傳感器與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法具有較高的相關(guān)性。此外據(jù)報(bào)道用小球藻[5]、銅綠假單胞菌烘干后死細(xì)胞[6]制成的微生物傳感器也可用于重金屬檢測(cè)。

甲醛含量已成為當(dāng)今居室、食品、紡織品中污染監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)重要安全指標(biāo)。湯鴻雁等[7]以枯草芽孢桿菌為固定化菌株，研制甲醛微生物傳感器，經(jīng)測(cè)試，與乙酰丙酮分光光度法的測(cè)定結(jié)果有很好的一致性。此外，微生物傳感器可以快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)農(nóng) 藥[8－9]殘 留。

2.2 食品和發(fā)酵工業(yè)

發(fā)酵工藝在食品、飲料等生產(chǎn)過程中應(yīng)用廣泛，溫度、溶氧、pH、培養(yǎng)基成分、細(xì)胞濃度、產(chǎn)物組成及含量等均是發(fā)酵過程的重要控制參數(shù)。快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)發(fā)酵過程控制具有重要的意義，目前葡萄糖、谷氨酸、乳酸的實(shí)時(shí)監(jiān)控已得到廣泛應(yīng)用。葡萄糖是發(fā)酵過程最重要的碳源。在這方面基于酶反應(yīng)的生物傳感器研制最早且已商業(yè)化，微生物傳感器的研制較晚，但更具潛力，Liang 等[10]利用可表達(dá)葡萄糖脫氫酶的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌構(gòu)建一種新型微生物傳感器，其對(duì)葡萄糖的線性范圍為50～800umol/L，檢測(cè)限為4umol/L，可抗其他糖類干擾，可再生，成本低，具有良好的穩(wěn)定性。

乙醇濃度是乙醇發(fā)酵、啤酒釀造工業(yè)過程中的主要控制參數(shù)，乙醇檢測(cè)在工業(yè)上具有特別重要的意義。Akyilmaz 等[11]用可產(chǎn)生乙醇氧化酶的熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）制成的安培計(jì)型傳感器可用于乙醇檢測(cè)，其對(duì)乙醇濃度的響應(yīng)線性范圍為0.5～7.5mmol/L，響應(yīng)時(shí)間為2min。Valach 等人[12]構(gòu)建一個(gè)安培計(jì)型微生物傳感器可在流動(dòng)注射分析（FIA）儀中測(cè)量乙醇，汪玉鳳等[13]利用以乙醇作為唯一碳源的嗜有機(jī)甲基桿菌（Methylobacterium organophilium）研制出基于氧電極的乙醇微生物傳感器，Wen 等[14]將嗜有機(jī)甲基桿菌固定于蛋膜結(jié)合氧電極研制出乙醇檢測(cè)傳感器，均取得滿意效果。

此外，Akyilmaz 等[15]將可產(chǎn)生賴氨酸氧化酶的啤酒酵母用戊二醛-明膠交聯(lián)固定到溶氧膜構(gòu)建可檢測(cè)賴氨酸的微生物傳感器，經(jīng)檢測(cè)該傳感器對(duì)賴氨酸的線性響應(yīng)范圍為1.0 umol/L～10umol/L，響應(yīng)時(shí)間為1min。

霉菌毒素是由霉菌或真菌產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)，攝入時(shí)，霉菌毒素可能會(huì)導(dǎo)致急性或慢性中毒。高效準(zhǔn)確的檢測(cè)霉菌毒素的含量對(duì)于食品安全具有重要的作用。據(jù)報(bào)道，以一株攜帶螢火蟲熒光素酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）研制的微生物傳感器可檢測(cè)出牛奶中玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的納摩爾級(jí)含量[16]。

2.3 臨床診斷

傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)各種疾病的診斷是一個(gè)耗時(shí)、復(fù)雜的過程，這使得在緊急情況下急救護(hù)理變得困難。微生物傳感器在診斷激素、DNA 損傷等方面提供了一種快速、準(zhǔn)確和廉價(jià)的方式。

Akyilmaz 等人[17]采用戊二醛交聯(lián)法將凍干的白腐真菌(Phanerochaete chrysosporiumME446) 固定在凝膠修飾的鉑電極上，研制出微生物傳感器用于測(cè)定腎上腺素，其檢測(cè)線性范圍為5～100umol/L，最低檢出限為1.04umol/L。

許多環(huán)境污染物可引起生物體內(nèi)DNA 的損傷。DNA 損傷是一種極其重要的毒理作用，是誘發(fā)基因突變、癌癥發(fā)生和發(fā)育畸形的關(guān)鍵因素。與基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的檢測(cè)方法相比細(xì)菌學(xué)檢測(cè)DNA 損傷的方法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便、高通量以及可以在線、實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)。Cheng 等[18]構(gòu)建了在SOS 反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的recA 基因啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)EGFP 基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌，開發(fā)出一種可靈敏檢測(cè)DNA 氧化損傷試劑的熒光細(xì)菌傳感器，可用于檢測(cè)醫(yī)院廢棄物、工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)污染以及核工業(yè)污染等領(lǐng)域的環(huán)境致癌物，是一種非常有前途的檢測(cè)方法。

3 展望

目前應(yīng)用最廣的是酶生物傳感器，其靈敏度較高、專一性較強(qiáng)且響應(yīng)時(shí)間短，不過酶提取純化難度較大，酶的保存期限相對(duì)較短，極易失活，只有在適當(dāng)?shù)睦砘瘲l件下或基于某些可溶性輔助因子基礎(chǔ)上酶才會(huì)產(chǎn)生作用。而依據(jù)某些微生物細(xì)胞制作的微生物傳感器沒有嚴(yán)格的理化條件限制，具有較長(zhǎng)的保存期限，使用成本低，但也存在一些缺點(diǎn)，如再生速度慢，比酶電極響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，由于微生物體內(nèi)酶系復(fù)雜，處于一定情況下具有較差的選擇性和專一性，這將是科研人員需要努力改進(jìn)的地方。微流控芯片技術(shù)(Microfluidics)，近幾年成為研究熱點(diǎn)，作為一種微型化的生化分析儀器，在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有巨大潛力，而電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、易微型化、功耗小、成本低的特點(diǎn)，兩種技術(shù)的融合將是微生物傳感器的發(fā)展方向。比如開發(fā)一種便攜式的微陣列微生物傳感器，使其具備高通量、快速、選擇性高和集成化的功能，可同時(shí)檢測(cè)空氣、水、土壤中存在的多種污染，那對(duì)于環(huán)境保護(hù)工作將是何等便利。

［1］胡磊，李軼.基于接枝二茂鐵介體的BOD 微生物傳感器[J].水資源保護(hù)，2012(4)：78-81.

［2］M.Di Lorenzo，T.P.Curtis，I.M.Head，et al.A single-chamber microbial fuel cell as a biosensor for wastewaters[J].Water Res，2009，43(13)：3145-3154.

［3］Y.Shen，M.Wang，I.S.Chang，et al.Effect of shear rate on the response of microbial fuel cell toxicity sensor to Cu(II)[J].Bioresour Technol，2013，136：707-710.

［4］李書鉞.一種發(fā)光細(xì)菌快速水質(zhì)毒性檢測(cè)儀的設(shè)計(jì)與研究[D].重慶大學(xué)，2011.

［5］J.Singh and S.K.Mittal.Chlorella sp.based biosensor for selective determination of mercury in presence of silver ions [J].Sensors &Actuators：B.Chemical，2012，165(1)：48-52.

［6］M.Yüce，H.Nazir and G.D o¨nmez.Utilization of heat-dried Pseudomonas aeruginosa biomass for voltammetric determination of Pb (II)[J].New Biotechnology，2011，28(4)：356-361.

［7］湯鴻雁.甲醛微生物傳感器的研究[D].河北科技大學(xué)，2010.

［8］X.Tang，T.Zhang，B.Liang，et al.Sensitive electrochemical microbial biosensor for p -nitrophenylorganophosphates based on electrode modified with cell surfacedisplayed organophosphorus hydrolase and ordered mesopore carbons[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，60.

［9］M.U.Anu Prathap，A.K.Chaurasia，S.N.Sawant，et al.Polyaniline-based highly sensitive microbial biosensor for selective detection of lindane[J].Anal Chem，2012，84(15)：6672-6678.

［10］B.Liang，L.Li，X.Tang，et al.Microbial surface display of glucose dehydrogenase for amperometric glucose biosensor [J].Biosens Bioelectron，2013，45：19-24.

［11］E.Akyilmaz and E.Din?kaya.An amperometric microbial biosensor development based on Candida tropicalis yeast cells for sensitive determination of ethanol[J].Biosensors and Bioelectronics，2005，20(7)：1263-1269.

［12］M.Valach，J.Katrlík，E.Sˇturdík，et al.Ethanol Gluconobacter biosensor designed for flow injection analysis.Application in ethanol fermentation off-line monitoring[J].Sensors and Actuators，B：Chemical，2009，138(2)：581-586.

［13］汪玉鳳，劉增倫，王焱.基于氧電極的乙醇微生物傳感器的在線檢測(cè)系統(tǒng)[J].傳感器與微系統(tǒng)，2011，30(1)：110-111，115.

［14］G.M.Wen，S.M.Shuang and C.Dong.An ethanol biosensor based on a bacterial cell -immobilized eggshell membrane [J].CHINESE CHEMICAL LETTERS，2012，23(4)：481-483.

［15］E.Akyilmaz，A.Erdogan，R.Ozturk，et al.Sensitive determination of L-lysine with a new amperometric microbial biosensor based on Saccharomyces cerevisiae yeast cells[J].Biosens Bioelectron，2007，22(6)：1055-1060.

［16］A.-L.Va¨limaa，A.T.Kivisto¨，P.I.Leskinen，et al.A novel biosensor for the detection of zearalenone family mycotoxins in milk [J].Journal of Microbiological Methods，2010，80(1)：44-48.

［17］E.Akyilmaz，M.Turemis and I.Yasa.Voltammetric determination of epinephrine by White rot fungi (Phanerochaete chrysosporium ME446) cells based microbial biosensor[J].Biosens Bioelectron，2011，26(5)：2590-2594.

［18］Z.Chen，M.Lu，D.Zou，et al.An E.coli SOS-EGFP biosensor for fast and sensitive detection of DNA damaging agents [J].J Environ Sci.(China)，2012，24(3)：541-549.