低壓低氧預處理對加速度暴露大鼠心肌損傷的保護作用

2014-09-17 15:25:32葉博張國榮黃俊梅

中國醫藥導報 2014年18期

葉博++++++張國榮++++++黃俊梅++++++尹哲++++++陶磊

[摘要] 目的從心肌抗氧化系統及一氧化氮（NO）代謝通路研究低壓低氧預處理對加速度環境下心肌細胞病理生理變化的影響，解釋航空加速度環境下心肌組織的損傷機制，探討低壓低氧預處理的保護機制。方法 24只雄性SD大鼠隨機分為3組（n=8），C組為空白對照組，HHP+10 Gz組為5000 m高空低壓低氧預處理4 h/d連續4 d后暴露10 Gz加速度組，10 Gz組為直接暴露10 Gz加速度組，各組按上述處理后，取大鼠心肌組織，委托北京華英生物技術研究室檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、熱休克蛋白-70（HSP-70）以及一氧化氮（NO）、亞硝酸鹽（NO2-）、硝酸鹽（NO3-）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、神經型一氧化氮合酶（nNOS）的變化。結果 SOD水平：C組[（8.242±1.562）U/mg]和HHP+10 Gz組[（7.660±1.208）U/mg]高于10 Gz組[（4.773±0.665）U/mg]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；CAT水平：C組[（2.348±0.382）U/mg]高于HHP+10 Gz組[（1.955±0.204）U/mg]和10 Gz組[（1.749±0.165）U/mg]，HHP+10 Gz組高于10Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；GSH-PX水平：C組[（91.864±38.788）U/mg]高于10 Gz組[（47.821±8.208）U/mg]，差異有統計學意義（P < 0.05）；GSH水平：C組[（0.748±0.182）μmol/g]和HHP+10 Gz組[（0.593±0.205）μmol/g]高于10 Gz組[（0.232±0.034）μmol/g]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；MDA水平：各組間差異無統計學意義（P > 0.054）；HSP-70水平：C組[（1.415±0.500）ng/mg]低于HHP+10 Gz組[（2.189±0.659）ng/mg]和10 Gz組[（2.452±0.926）ng/mg]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；NO水平：C組[（1.932±0.496）μmol/g]低于HHP+10 Gz組[（2.751±0.784）μmol/g]和10 Gz組[（3.185±0.769）μmol/g]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；NO2-水平：C組[（1.277±0.279）μmol/g]低于HHP+10 Gz組[（1.800±0.568）μmol/g]和10 Gz組[（1.970±0.362）μmol/g]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；NO3-水平：C組[（2.191±0.426）μmol/g]低于HHP+10Gz組[（2.898±0.500）μmol/g]和10 Gz組[（2.995±0.445）μmol/g]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；eNOS水平：C組[（3.726±0.498）U/mg]低于HHP+10 Gz組[（5.081±0.994）U/mg]和10 Gz組[（5.937±1.423）U/mg]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；iNOS水平：C組[（3.668±0.379）U/mg]低于HHP+10 Gz組[（4.382±0.567）U/mg]和10 Gz組[（4.986±1.318）U/mg]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；nNOS水平：C組[（0.830±0.117）U/mg]低于HHP+10 Gz組[（1.044±0.190）U/mg]和10 Gz組[（1.226±0.300）U/mg]，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。結論低壓低氧預處理可以降低加速度對心肌造成的氧化損傷，對心肌具有保護作用，其機制與低壓低氧預處理增強了大鼠體內抗氧化酶活性，減輕氧化應激對NOS的激活從而抑制NO的大量釋放有關。

[關鍵詞] 加速度；低壓低氧；大鼠；心肌損傷；抗氧化；一氧化氮

[中圖分類號] R852.21[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）06（c）-0012-05

Protection of hypobaric hypoxia preconditioning on myocardial injuries of rats after acceleration exposured

YE Bo ZHANG Guorong▲ HUANG Junmei YIN Zhe TAO Lei

Department of Anaesthesiology, Air Force General Hospital, Beijing 100142, China

[Abstract] Objective To evaluate the effect of hypobaric hypoxia preconditioning (HHP) on myocardial cells pathological physiology changes under acceleration environment from myocardial antioxidant system and NO metabolic pathways. To explain the mechanism of myocardial tissue damage by acceleration environment, explore the protection mechanism of HHP. Methods 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups (n=8), C group was the blank control group, HHP+10 Gz group was 5000 m altitude hypoxic preconditioning 4 h/d for 4 days then exposure to 10 Gz acceleration, 10 Gz group was directly exposed to 10 Gz acceleration. After the treatment above, SOD, CAT, GSH-PX, GSH, MDA, HSP-70 and NO, NO2-, NO3- , eNOS, iNOS, nNOS content of the cardiac muscle tissue of rats were determined by Beijing Huaying Biotechnology Research Company. Results SOD level: group C [(8.242±1.562) U/mg] was higher than group 10 Gz [(4.773±0.665) U/mg], group HHP+10 Gz [(7.660±1.208) U/mg] was higher than group 10 Gz, the differences were statistically significant (P < 0.05). CAT level: group C [(2.348±0.382) U/mg] was higher than group HHP+10 Gz [(1.955±0.204) U/mg] and group 10 Gz [(1.749±0.165) U/mg], group HHP+10 Gz was higher than group 10Gz, the differences were statistically significant (P < 0.05). GSH-PX level: group C [(91.864±38.788) U/mg] was higher than group 10 Gz [(47.821±8.208) U/mg] , the differencs was statistically significant (P < 0.05). GSH level: group C [(0.748±0.182) μmol/g] and group HHP+10 Gz [(0.593±0.205) μmol/g] were higher than group 10 Gz [(0.232±0.034) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). MDA level: there was no statistically significant differences (P > 0.05). HSP-70 levls: group C [(1.415±0.500) ng/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(2.189±0.659) ng/mg] and group 10 Gz [(2.452±0.926) ng/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). NO level: group C [(1.932±0.496) μmol/g] was lower than group HHP+10 Gz [(2.751±0.784) μmol/g] and group 10 Gz [(3.185±0.769) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). NO2- level: group C [(1.277±0.279) μmol/g] was lower than group HHP+10 Gz [(1.800±0.568) μmol/g] and group 10 Gz [(1.970±0.362) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). NO3- level: group C [(2.191±0.426) μmol/g] was lower than group HHP+10 Gz [(2.898±0.500) μmol/g] and group 10 Gz [(2.995±0.445) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). eNOS level: group C [(3.726±0.498) U/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(5.081±0.994) U/mg] and group 10 Gz [(5.937±1.423) U/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). iNOS level: group C [(3.668±0.379) U/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(4.382±0.567) U/mg] and group 10 Gz [(4.986±1.318) U/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). nNOS level: group C [(0.830±0.117) U/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(1.044±0.190) U/mg] and group 10 Gz [(1.226±0.300) U/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). Conclusion HHP can reduce oxidative damage of myocardial tissue caused by acceleration and has myocardial protective effect, the mechanism is related to enhancing the activity of antioxidant enzymes and reducing oxidative stress on the activation of NOS and then inhibiting the release of NO in rats.

[Key words] Acceleration; Hypobaric hypoxia; Rats; Myocardial injuries; Anti-oxidant; NO

重復暴露于高正加速度（+Gz）對飛行員和動物心腦血管系統的不良影響已經引起了醫學工作者的關注[1-2]。現已證實，+Gz作用可引起心肌收縮性能降低，心臟泵血功能下降[3-4]。病理研究表明，除心肌出現明顯的超微結構改變外，間質小血管內皮細胞出現腫脹，飲泡增多，胞質出現指狀突起凸向管壁，血管腔內見較多血小板聚集、附壁[5]。重復+Gz暴露后，大鼠心肌血管內皮細胞出現明顯損傷，其胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達增多，提示黏附分子誘導的炎性反應參與了高+Gz應激導致的心肌損傷[6]。此外，+Gz暴露后，血漿內皮素含量明顯增加，可引起冠狀動脈和周圍血管的強烈收縮，導致回心血量減少，心泵功能降低[7]。

間歇性低壓低氧預處理（hypobaric hypoxia preconditionin，HHP）是指預先通過間斷反復短時間非致死性低壓低氧應激處理后，機體組織細胞獲得一種抗缺氧/缺血內源性保護，對隨后長時間致死性缺血/缺氧損傷的高度耐受性處理[8]。

本研究從心肌組織抗氧化系統以及一氧化氮（NO）的代謝通路研究低壓低氧預處理對加速度環境下心肌細胞病理生理的變化，解釋航空加速度環境心肌組織損傷機制，探討低壓低氧預處理的保護機制，為進一步研究航空環境對人體的影響提供實驗依據，為尋找合適的對抗加速度應激導致心肌損傷的防護措施打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物雄性SD大鼠24只，體重（294.71g±9.98）g，由航空航天醫學研究院提供。

1.1.2 藥品與試劑2.5%戊巴比妥溶液（航空航天醫學研究院提供），超氧化物歧化酶（SOD）含量試劑盒、過氧化氫酶（CAT）含量試劑盒、谷胱甘肽（GSH）含量試劑盒、丙二醛（MDA）含量試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）含量試劑盒、熱休克蛋白-70（HSP-70）含量試劑盒、一氧化氮（NO）含量試劑盒、亞硝酸鹽（NO2-）含量試劑盒、硝酸鹽（NO3-）含量試劑盒、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）含量試劑盒、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）含量試劑盒、神經型一氧化氮合酶（nNOS）含量試劑盒，以上試劑盒均由南京建成公司提供。

1.1.3 儀器與設備低壓低氧艙（航空航天醫學研究院），動物離心機（航空航天醫學研究院），BCM-130D超凈臺（蘇凈集團安泰公司），手術器械（空軍總醫院手術室提供），標本袋（空軍總醫院手術室提供）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組將雄性SD大鼠領回后，先飼養1周并使其適應實驗環境，排除驚嚇、環境等因素對大鼠的影響。隨機分為3組，每組8只，C組：空白對照組；HHP+10 Gz組：低壓低氧預處理后暴露10 Gz加速度組；10 Gz組：單純暴露10 Gz加速度組。

1.2.2 低壓低氧預處理方案參照劉杰等[9]的低壓低氧方案，將HHP+10 Gz組大鼠置于低壓氧艙接受4 d相當于5000 m高空的低壓低氧處理，每天4 h。

1.2.3 加速度暴露方案將HHP+10 Gz組及10 Gz組大鼠置于動物離心機中，每次兩只進行加速度暴露。動物離心機的半徑為2 m，可模擬的正加速度范圍為+1～+12 Gz ，由計算機進行加速度程序控制。將大鼠水平固定于離心機的轉臂上，頭部朝向離心機旋轉軸心，具體方案為水平加速度+10 Gz，峰值作用時間為5 min ，加速度增長率為1 GPs。加速度暴露結束后立即進行相應檢測。

1.2.4 生化指標檢測采用2.5%戊巴比妥溶液，按照每100 g體重0.5 mL腹腔注射對大鼠進行麻醉，麻醉起效后，斷頭處死大鼠，取心肌組織。標本委托北京華英生物技術研究室采用比色法進行SOD、CAT、GSH-PX、GSH、MDA、HSP-70、NO、NO2-、NO3-、eNOS、iNOS、nNOS含量的測定。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織抗氧化系統指標比較

實驗結果顯示，SOD水平：C組與HHP+10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），C組與HHP+10 Gz組均高于10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；CAT水平：C組高于HHP+10 Gz組和10 Gz組，HHP+10 Gz組高于10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；GSH-PX水平：C組與HHP+10 Gz組、HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異均無統計學意義（均P > 0.05），C組高于10 Gz組，差異有統計學意義（P < 0.05）；GSH水平：C組與HHP+10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），C組與HHP+10 Gz組均高于10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；MDA水平：各組間比較差異均無統計學意義（均P > 0.05）；HSP-70水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織一氧化氮代謝通路指標比較

實驗結果顯示，NO水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；NO2-水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；NO3-水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；eNOS水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；iNOS水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；nNOS水平：C組低于HHP+10 Gz組和10 Gz組，差異均有統計學意義（均P < 0.05），HHP+10 Gz組與10 Gz組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

CAT、GSH-PX、SOD等抗氧化酶構成人體重要的抗氧化酶系統，相互協同以減少活性氧族的產生，防止脂質過氧化及其中間產物對機體的損害。SOD是體內唯一清除過氧化物的酶，通過它的作用將過氧化物變成H2O2，當人體產生的H2O2超過機體的清除能力在體內蓄積時，其活性下降[10]。CAT是一類以鐵卟啉為輔基的結合酶，具有較強的自由基清除功能，對組織的氧化損傷有防護作用[11]。過氧化氫在過氧化氫酶的作用下轉化為水和分子氧[12]，阻止H2O2在鐵螯合劑存在的條件下與O2-反應生成更有害的OH-[13]。CAT在滅活H2O2的同時消耗增加，從而造成其活性下降。MDA為脂質過氧化終產物，測試MDA的量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度[14-16]。GSH-PX主要清除脂類氫過氧化物（ROOH），并協同CAT清除H2O2，抑制ROS生成。GSH-PX以硒氫基（-SeH）的形式發揮作用，與GSH反應分解體內的H2O2和脂質過氧化物，分別生成相應的水和醇化物，從而使細胞膜和其他生物組織免受過氧化損傷，當CAT含量顯著減少時，GSH-PX可代替CAT催化H2O2分解。本研究顯示，10 Gz組較HHP+10 Gz組SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平降低，MDA水平增加，可見，低壓低氧預處理后，增強了心肌組織的抗氧化能力，使加速度對心肌組織造成的氧化應激損傷程度減小，對心肌有保護作用。

HSP-70是HSP家族中最保守和最主要的一類，具有廣泛的生物學功能，包括分子伴侶功能、免疫功能、抗氧化功能、抗細胞凋亡功能、提高細胞的應激耐受性功能等功能，缺血/缺氧應激早期，高濃度的HSP-70有效地聚集在神經元染色體和核質內，是其能耐受缺氧缺血性損傷的一個重要標志[17]。本實驗結果顯示，HHP+10 Gz組較10 Gz組HSP-70水平明顯增高，可見低壓低氧激活了大鼠體內HSP-70的活性，增強了心肌的抗氧化能力。

NO作為一種相對穩定的氣體自由基，對人體有雙重的生物學作用。一方面其可以調節人體正常的生理功能，如血液循環、信息傳遞、能量代謝及免疫調節等；另一方面，體內NO合成量過多或過少均會造成對機體的危害，如低血壓休克、細胞損傷或高血壓、動脈粥樣硬化和缺血等[18-19]。NO產生的經典途徑依賴于一氧化氮合酶（NOS）的活性，NOS可分為3類，即主要存在于內皮細胞中的eNOS、存在于神經細胞中的nNOS以及存在于巨噬細胞、膠質細胞中的iNOS。NOS可逐步氧化L-精氨酸為L-胍氨酸，從而產生NO。產生的NO可與多種分子，如蛋白質、核酸、脂類、碳水化合物和其他自由基發生反應，也可迅速氧化為亞硝酸及硝酸[20]。此外有針對內皮細胞的研究報道，小劑量H2O2可使eNOS發生磷酸化而使其活性增強，進而催化L-精氨酸產生大量NO[21]。本實驗數據顯示，HHP+10 Gz組及10 Gz組NO含量均高于C組，且eNOS、iNOS及nNOS含量增加，NO2-和NO3-水平升高，可見加速度產生的應激反應使NOS活性增加，催化L-精氨酸產生大量NO，NO又迅速氧化為NO2-和NO3-。HHP+10 Gz組數據較10Gz組降低，可見低壓低氧預處理后暴露加速度降低了加速度對心肌的氧化損傷，使NO釋放量減少，對心肌有保護作用，但本實驗HHP+10 Gz組及10 Gz組數據統計學差異不顯著，可通過擴大樣本量進一步證實。

綜上所述，可以得出結論：低壓低氧預處理可以降低加速度對心肌造成的氧化損傷，對心肌具有保護作用，其機制與低壓低氧預處理增強了大鼠體內抗氧化酶活性，減輕氧化應激對NOS的激活從而抑制NO的大量釋放有關。

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（收稿日期：2014-03-12本文編輯：程銘）