靈芝酸對癇樣放電海馬神經元ERK1/2磷酸化水平的影響

欒 倩，劉 蕾，劉君星，馬小茹，王芳芳，梁衍鋒，吳佳梅，王淑秋

(佳木斯大學基礎醫學院病理生理教研室，黑龍江佳木斯154007)

大鼠絲裂原活化蛋白激酶1/2(ERK1/2)，在腦內含量豐富，可被激活磷酸化參與一系列神經系統疾病，靈芝孢子粉已證實有抗癲癇作用，靈芝酸作為靈芝孢子粉的一種有效成分，其作用機制與ERK1/2磷酸化水平是否有關有待進一步探討。本實驗擬觀察靈芝酸對ERK1/2磷酸化水平的影響，探討靈芝酸抗癲癇的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物與試劑：24h內新生Wistar大鼠，購自大連醫科大學動物中心。種植培養液：NB培養基(Cat.No.21103049，Gibco)，2%B-27(Cat.No.17504044，Gibco)，0.5mmol/L的L-谷氨酰胺，10%的FBS，青霉素-鏈霉素溶液；維持培養液：NB培養基，2%的B-27，0.5mmol/L的L-谷氨酰胺，青霉素-鏈霉素溶液；D-Hanks液；胰蛋白酶；大鼠絲裂原活化蛋白激酶1/2酶聯免疫分析試劑盒；NSE抗體(Cat.No-BA0535，Wuhan Boster Bio-Engineering Ltd，China)；山羊抗兔FITC熒光二抗(Cat.No.BA1105，Wuhan Boster Bio-Engineering Ltd，China)。

1.1.2 儀器：37℃恒溫箱；酶聯免疫檢測儀(BioTek公司)，激光共聚焦顯微鏡FV1000(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元的原代培養與鑒定

取24h新生大鼠，迅速端頭取腦，分離出海馬組織放入冷的D-Hanks液中漂洗3次，將組織塊剪成1mm3的碎塊，加入500μL的0.125%胰蛋白酶，37℃培養箱內消化3～4min后取出，迅速加入等量種植液終止消化，輕輕吹打成懸液，加入離心管1000r/min離心5min，棄上清，加種植液，巴氏滴管反復輕輕吹打，200目篩網過濾，去少量細胞計數，放入37℃、5%CO2培養箱內培養，24h后全量換成維持液，以后每2～3天半兩換液。取出培養9d的神經細胞，吸掉培養液用0.01molPBS洗2遍，然后加入兔抗鼠NSE抗體孵育一抗，放在4℃冰箱過夜，取出在避光條件下，加上山羊抗兔FITC熒光二抗，在熒光顯微鏡下對原代培養的神經元進行鑒定。

1.2.2 海馬神經元模型建立

將培養至第9d的海馬神經元，全液更換成無鎂細胞外液(124 mmol NaCl，3.3 mmol KCl，26mmol NaHCO3，1.2mmol KH2PO4，2.5mmol CaCl2，10mmol Glucose，pH7.2 ～ 7.4，290+10mOsm)處理3h，即得海馬神經元的癲癇樣放電模型，再恢復正常培養。

1.2.3 MTT法測定靈芝酸對海馬神經元最大無毒濃度

將濃度約為1×105/mL細胞懸液加入到96孔板中培養至第9d，加入不同濃度的無菌靈芝酸培養液混懸液，終濃度為 5，10，20，40，80，160，320，640μg/mL，每組設 8 個復孔，同時設立正常細胞對照，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，連續觀察24h。每孔加入20μL 0.5%MTT溶液，繼續培養4h后終止培養，吸去孔內培養液。然后每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)后在酶聯免疫檢測儀檢測每個孔的吸光度值，OD490nm。經測算取靈芝酸最適無毒濃度20μg/mL，80μg/mL，320μg/mL。

1.2.4 靈芝酸最適無毒濃度分組

將海馬神經元接種于35mm培養皿內，培養至第9天時，隨機選取培養的細胞進行分組：(1)正常對照組：將維持培養液全液換成正常細胞外液處理3h，然后恢復正常培養3h后取材；(2)模型組：將維持培養液全液換成無鎂細胞外液處理3h，然后恢復正常培養3h后取材［1］；(3)治療組：將維持培養液全液換成無鎂細胞外液處理3h，全液再換成維持培養液配制的靈芝孢子粉混懸液(濃度為20mg/m L，80mg/mL，320mg/mL)處理3h后取材。

1.2.5 ELISA分析

用PBS稀釋細胞懸液，通過反復凍融，以使細胞破壞，離心收集細胞內成分。在酶標包被板上加樣、溫育、洗滌、終止，每組樣品重復3個復孔，并設置空白對照組，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。制作標準曲線，計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品OD值代入方程式，計算出查出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即樣品的實際濃度。

1.3 統計學分析

采用平均數士標準差()表示，應用IBM SPSS 21統計軟件進行數據統計學處理，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬神經元NSE鑒定

經NSE免疫熒光染色顯示，第9天神經元發育成熟，神經元胞體飽滿，突起增大，成團狀聚集、交織成網。

2.2 MTT檢測靈芝酸對海馬神經元最大無毒濃度

隨著靈芝酸濃度的不斷增加，靈芝酸對海馬神經元細胞的最適無毒濃度為80μg/m L，因此本實驗采用20μg/m L，80μg/mL，320μg/mL 進行后續試驗。

2.3 酶聯免疫分析ERK1／2磷酸化水平的表達

結果顯示各實驗組中均有ERK1／2的表達，模型組ERK1／2的表達高于正常對照組（P＜0.05）；并且各治療組均能降低ERK1／2磷酸化水平，差異都有統計學意義；各濃靈芝酸組之間比較，差異都有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各實驗組中均有ERK1／2的表達

3 討論

我們采用NB培養基聯合B27添加劑離體培養海馬神經元，培養第4天加入阿糖胞苷，這種培養方式獲得了相對純度較高的海馬神經元，培養至第9天，神經元生長更加旺盛，胞體增大，突起增多伸長，粗大，交織成網狀，此時所培養的神經元是生長的最旺盛階段［2］。NSE免疫熒光技術對離體培養神經元進行鑒定，利用無鎂細胞外液培養得到離體海馬神經元的永久性癲癇樣放電模型，可用于細胞水平上神經系統功能、結構的研究。通過 MTT方法結果的觀察，得出靈芝酸的最適高中低無毒濃度（20μg／m L，80μg／m L，320μg／m L）。

ERK1／2是MAPK家族中研究最早最為透徹的一個激酶，通過大量體內和體外研究，ERK1／2在多種癲癇模型實驗中已證實參與了癲癇的發生和發展。癲癇是神經科常見疾患，盡管目前臨床有多種治療方法，但主要的治療手段仍是抗癲癇藥物治療控制其發作［3］。近年來，中藥在抗癲癇方面研究不斷加深，本研究通過離體培養海馬神經元，觀察靈芝酸對無鎂細胞外液致癇性細胞模型中ERK1／2磷酸化的表達情況，表明靈芝酸能抑制海馬神經元中ERK1／2通路的激活，為研究靈芝酸對抗癲癇作用提供了實驗依據，但目前對苔蘚纖維的負向調節機制還有待研究，可能與其上游激活因子腦源性神經營養因子（BDNF）和神經營養因子-3（NT-3）有關［4，5］。

［1］趙春霞，王淑秋，叢嶺，等.靈芝孢子粉對無鎂活化海馬神經元NGF的影響［J］.黑龍江醫藥科學，2010，33（4）：8-15

［2］張金波，王淑秋，朱金玲，等.大鼠海馬神經細胞原代培養技術的優化［J］.黑龍江醫藥科學，2009，32（4）：20-21

［3］趙秀鶴，遲兆富，王勝軍，等.ERK信號轉導通路在癲癇大鼠腦部作用的研究［J］.神經損傷與功能重建，2006，1（1）：14-16

［4］夏杰，陳陽美.MAPKERK1／2信號轉導途徑在實驗性癲癇大鼠海馬結構的激活［J］.重慶醫科大學學報，2005，30（3）：363-365

［5］劉華.丙戊酸對癲癇后ERK1／2介導的苔蘚纖維出芽干預的實驗研究［D］.［碩士學位論文］.重慶醫科大學，2008