急性白血病病人XIAP和Caspase-3的表達及其臨床意義

段翠翠，王慶國，王為光，鮑瑩瑩，張 純

（佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003）

白血病是一種血液系統惡性腫瘤，嚴重危害著人類的健康。我國白血病發病率為2.76／10萬。在惡性腫瘤死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性）［1］。它同實體腫瘤一樣，腫瘤細胞的過度增殖和凋亡受抑制是其發生發展的重要機制［2］。凋亡抑制蛋白（IAP）是近年來新發現的一類蛋白家族，其可以對抗各種凋亡誘導因素的作用，抑制細胞凋亡，與腫瘤疾病的發生、發展關系密切。至今為止人類已經發現了8個IAP家族成員，研究發現它的抗凋亡能力遠遠超過于Bc1-2家族，在腫瘤疾病的發生機制中發揮著重要的作用［3］，而XIAP的生物學機制及結構是IAP家族中研究最為明確的凋亡抑制蛋白［4］，而且其在該家族中被認為是最強、最有效的Caspase抑制物。Caspase-3是重要的凋亡執行者之一，在細胞凋亡過程中處于中心地位，是細胞凋亡的主要效應因子［5，6］，Caspase-3被激活后能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及結構蛋白等誘導的細胞凋亡，在腫瘤的發生中起著重要的作用。本研究應用逆轉錄聚合酶鏈反應方法，檢測AL患者及健康成人骨髓細胞中XIAP、Caspase-3 mRNA的表達，探討XIAP及Caspase-3在AL發生、發展過程中的作用以及二者相關性，為臨床診療與預后提供有價值的參考指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組（AL組）：AL患者50例均系在佳木斯大學附屬第一醫院血液科自2012-03～2013-06住院治療患者，男24例，女26例，年齡18～74歲，中位年齡48歲。包括初治32例，其中急性淋巴細胞白血病（ALL）10例，急性髓細胞白血病（AML）22例；復發18例，其中ALL7例，AML 11例，AL患者均接受兩個正規療程化療后，以骨髓緩解率作為療效的判斷標準。以上病人的診斷及療效標準均參照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》［7］。

1.1.2 對照組（N組）：選取佳木斯大學附屬第一醫院門診健康體檢的成人共30例，男18例，女12例，年齡26～58歲，中位年齡47歲。

1.2 單個核細胞分離及總RNA提取

無菌操作采集白血病患者骨髓液2m L后肝素抗凝。用人淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque PREMIMU，密度為1.077g／m L，上海新睿生物科技有限公司）2m L，以2 000r／min離心15min，分離單個核細胞。然后應用PBS液洗滌5×106個單個核細胞，加入0.8mL Trizol液 （Invitrogen公司），混勻后在-80℃下保存。所有操作要嚴格按照Invitrogen公司的試劑盒的說明書進行，提取上述單個核細胞中的總RNA，RNA的完整性采用變性凝膠電泳檢測，并使用Beckman DU640蛋白核酸分析儀進行RNA濃度和純度（A260／A280的值在1.8～2.0）的檢測。

1.3 逆轉錄、聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析

1.3.1 逆轉錄PCR試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，Trizol試劑提取細胞總RNA，應用752型紫外分光光度計測定260nm的吸收值來確定RNA的含量，以OD260相當于40Lg RNA來計算RNA的產率，OD260在1.8～2.0時可以認為提取的RNA純度很高。RT-PCR采用一步法，按操作手冊進行。內參照β-action及PCR引物都是由上海生工生物技術有限公司提供的。RT-PCR反應條件：cDNA合成和預變性1個循環：39℃15min，94℃2min；PCR擴增35個循環：94℃15s，59℃30s，72℃1min，終延伸1個循環72℃10min。制備1.7%瓊脂糖凝膠，取10μLPCR擴增產物進行電泳，在紫外燈下進行拍照，并采用天能全自動數碼凝膠圖像分析系統進行拍照并進行灰度掃描分析，通過比較電泳條帶的光密度值，獲得Caspase-3及XIAP m RNA的相對表達量，結果以均數±標準差（）表示。

1.3.2 引物的序列XIAP：XIAP上游引物：5'-CCGTGCGGTGCTTTAGTTGTC-3'，下 游 引 物：5'-ATGGCAGGGTTCCTCGGGTAT-3'，擴增產物的長度為301 bp；Caspase-3引物：上游5'TGTCGATGCAGCAAACCTCA 3'，下游5'TTTCAGCATGGCACAAAGCG 3'，擴增產物469 bp；以β-actin作為內參照，其上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，擴增產物的長度為205 bp。

1.3.3 PCR產物分析取10m L擴增產物與2μL 6×Loading Buffer混合后在1.7%瓊脂糖凝膠中120V電泳30min。急性白血病初治組、和復發組及對照組在205bp和301bp處均可見一條亮帶，分別為β-actin和XIAP m RNA；在469 bp處為Caspase-3 mRNA。應用紫外線透射儀觀察并且拍照，經Metamorph ImagingSight軟件進行分析并且讀取光密度值，取XIAP mRNA／B-actin、Caspase-3 m RNA／β-actin光密度比值進行半定量分析，各標本重復3次，取平均值。

1.4 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。XIAP、Caspase-3的相關性采用Spearman等級相關進行相關分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 AL組XIAP及Caspase-3的表達

AL組病人與對照組病人均表達不同水平的XIAP及Caspase-3，見圖1、圖2。AL組XIAP的表達水平為（0.679±0.132），明顯高于對照組（0.486±0.059），差異有統計學意義（P＜0.05）；AL組Caspase-3的表達水平為（0.178±0.057），明顯高于對照組（0.369±0.062），差異有統計學意義 （P＜0.05）。兩者呈負相關 （r=-0.837，P＜0.05）。而ALL與AML病人XIAP及Caspase-3表達水平差異無顯著性 （P＞0.05）。

（M：Marker；1對照組；2、3：初治 AL組；4、5：復發 AL組）圖1 XIAP基因RT-PCR檢測

（M：Marker；1：對照；2、3：初治 AL；4、5：復發 AL）圖2 Caspase-3基因RT-PCR 檢測

2.2 XIAP和Caspase-3在初治AL組和復發AL組中的表達

XIAP在初治AL組的表達水平分別為（0.596±0.031），明顯低于復發AL組（0.828±0.107）差異有統計學意義（P＜0.05）；Caspase-3在初治AL組的表達水平分別為（0.207±0.043），明顯高于復發 AL組（0.126±0.039）差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 XIAP及Caspase-3的表達與患者臨床療效的關系

根據急性白血病初治組XIAP及Caspase-3的表達水平 （χ1=0.596；χ2=0.206）將其分為高、低表達組（XIAP／β-actin≥0.596為高表達，＜0.596為低表達；Caspase-3／β-actin≥0.206為高表達，＜0.206為低表達）。XIAP高表達組經過正規治療兩個療程完全緩解率為26.7%（4／15），而XIAP低表達組完全緩解率為64.7%（11／17），兩者比較差異有顯著性（χ21=4.630，P＜0.05）；Caspase-3高表達組經過正規治療兩個療程完全緩解率為68.8%（11／16），而Caspase-3低表達組完全緩解率為25.0%（4／16），兩者比較差異有顯著性 （χ22=6.149，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤細胞凋亡受抑在腫瘤的發生發展中發揮著極其重要的作用，研究發現不同的凋亡途徑都是通過激活Caspase的完成的［8］。而Caspase-3被認為是Caspase級聯反應中最為重要的效應酶，在凋亡途徑最后的執行階段常常起到不可替代的核心作用，其被稱為凋亡的”執行者”［9］。鑒于Caspase-3在凋亡中發揮的關鍵作用，它已經成為了近幾年凋亡研究的熱點。

XIAP系分子結構研究得最清楚的凋亡抑制蛋白IAP家族的一員，它是內源性凋亡抑制蛋基因家族中最有效的Caspase抑制劑［11］，大量研究表明，XIAP在腫瘤細胞的表達水平顯著高于正常組織，提示其過度表達可以抑制多種刺激誘導的細胞凋亡。研究發現XIAP可以通過其BIR2、BIR3分別抑制Caspase-3、Caspase-7的活性及Caspase-9的活性及環指結構域泛素降解Caspases等多種途徑而發揮抗凋亡作用。

本研究證實，在急性白血病患者骨髓液中XIAP m RNA的表達明顯高于正常對照組，caspase-3 mRNA的表達明顯低于對照組，有統計學意義，說明二者在AL的發生發展中關系密切，二者可能是白血病細胞凋亡信號傳導網絡中的最重要的環節之一。并且發現XIAP和Caspase-3的表達具有負相關性，二者經Spearman相關分析顯示r=-0.837，P＜0.05。AL初治組XIAP的表達水平低于復發組XIAP表達水平（P＜0.05）；AL初治組Caspase-3的表達水平高于復發組Caspase-3表達水平，而且XIAP高表達組經過兩個正規療程化療后完全緩解（CR）率低于低表達組（P＜0.05），Caspase-3高表達組的完全緩解率高于低表達組（P＜0.05），提示二者的表達與化療藥物的敏感性有一定的聯系，XIAP的高表達及Caspase-3低表達可能是導致急性白血病細胞對化療藥物不敏感的原因之一。實驗中ALL組與AML組比較，XIAP、Caspase-3表達水平無統計學意義，提示XIAP、Caspase-3與AL患者的臨床分型可能無關，這一結論尚有待于進一步擴大病例數繼續研究。因此，XIAP、Caspase-3可能參與了急性白血病的發生發展，可為急性白血病的臨床診療與預后提供有價值的參考指標。

［1］于廣晴，張家軍，石亞男.NPRL2在急性白血病中的表達［J］.黑龍江醫藥科學，2011，34（1）：50-51

［2］張會營，江彩玉，管洪.急性白血病病人XIAP表達及其臨床意義［J］.齊魯醫學雜志，2011，26（3）：206-208

［3］劉建剛，管洪在，盧偉.急性白血病病人白血病細胞Survivin基因的表達及其臨床意義［J］.青島大學醫學院學報，2007，43（4）：302-304

［4］Deveraux Q L，Reed J C.IAP family proteins-supressorsof apoptosis［J］.Genes Dev，1999，13（3）：239-252

［5］Akao Y，Yamada H，Nakagawa Y.Arsenic-induced apoptosis inmalignant cells in vitro［J］.Leuk Lymphoma，2000，37：53-63

［6］AnuradhaCD，Kanno S，Hirano S.Oxidative damage ofmitochondriais a preliminary step toCaspase-3 activation in fluoride-induced apoptosisin HL-60 cells［J］.Free Radic Biol Med，2001，31：367-373

［7］張之南.血液病診斷及療效標準［M］.第2版.北京：科學出版社，1998，168-194，219-227

［8］李東，霍鋼，王亮，等.侵襲性垂體腺瘤smac，XIAP，caspase-3的表達［J］.中國神經精神疾病雜志，2009，35（11）：673-676

［9］Meggiato T，Calabrese F，De Cesare CM，et al.C-jun and cpp32（caspase3）in human pancreatic cancer：relation to cell prolifera-tion and death［J］.Pancreas，2003，26（1）：65-70

［10］于濤，高慶紅，溫玉明.血管瘤發病機制的研究進展［J］.國際口腔醫學雜志，2007，34（2）：122-124

［11］Deveraux QL，LeoE，Stennicke HR，et al.Cleavage ofhuman inhibitorof apoptosis protein XIAP Results in fragmentswith distinct specific-ities for caspases［J］.EMBO J，1999，18（19）：5242-5251