PEDF與VEGF在子宮內膜異位癥發生發展中的作用

閆喜秋，盧北燕

(佳木斯大學附屬第一醫院婦產科，黑龍江佳木斯154003)

子宮內膜異位癥(內異癥，endometriosis，EMT)是指具有生長功能的子宮內膜組織(腺體和間質)出現在子宮腔被覆內膜及宮體肌層以外的其他部位。內異癥的發病原因很多，如經血逆流學說，遺傳學說，異位子宮內膜局部雌激素分泌增多［1］等。EMT雖是一種良性疾病，但卻表現出與惡性腫瘤相似的生物學特性，如細胞的非典型性增生、侵潤、轉移、新生血管形成及遺傳的不穩定性等。近年研究發現，血管內皮生長因子能夠直接作用于血管內皮細胞導致新生血管生成，且它的表達受卵巢分泌的雌激素調控而呈周期性變化，在分泌晚期達高峰。因此很多研究也表明，內異癥的治療在抗血管治療的方向取得了突破，異位病灶的新生血管被抑制了，同時也抑制了異位病灶的生長，從而達到治療的目的。其中色素上皮衍生因子作為最新發現的、天然的、最強的血管生成抑制劑，在抑制新生血管生成方面發揮著重要的作用。研究還發現，內異癥患者腹腔液和血液中PEDF蛋白表達較低，且和內異癥的臨床分期相。PEDF還具有一個特點：可以抑制細胞移行，呈現劑量依賴性，更重要的是PEDF不損傷已有的血管的內皮細胞，提示PEDF可能在內異癥的發病機制中發揮重要作用。VEGF與PEDF可以看做，是兩類重要的血管生成調節因子。本研究采用，免疫組化法檢測組織中的VEGF與PEDF蛋白表達，以探討二者在EMT形成過程中的相互作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

(1)研究組：選擇34例EMT病人作為研究組，從2013-01-01～2014-01-01，在佳木斯大學附屬第一醫院婦科經腹或腹腔鏡手術，同時術后病理確診為子宮內膜異位癥，腹腔鏡手術者可以通過刮宮取得異位內膜(排除同時合并子宮腺肌癥和子宮肌瘤、且年齡35～40歲，子宮次全切及子宮全切除者可直接取得在位內膜，病理確定子宮內膜期別，增生期14例，分泌期20例，均為初治患者。根據1987年修正后的美國生育學會分期標準(r-AFS)：I～II期16例，III～IV期18例。

(2)對照組：34例同期非內膜疾病(子宮肌瘤或行絕育術患者等良性病變)作為對照組，行子宮全切術或子宮次全切術。而且均排除患有內異癥者，年齡35～40歲，病理確定為正常子宮內膜，增生期16例，分泌期18例。

所有患者月經規律，無放置宮內節育器無內分泌免疫及代謝性或炎癥性疾病史，手術前3個月內未接受過激素治療，6個月內無哺乳妊娠史。而且患者知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人VEGF單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。兔抗人PEDF多克隆抗體購自Abcom公司。

1.3 免疫組織化染色

術中收集新鮮標本組織，用10%甲醛溶液固定，常規脫水及石蠟包埋。切片機連續切片，厚度均為5μm，備用。檢測VEGF與PEDF在各組研究對象中的蛋白表達，實驗方法嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.4 統計學處理

采用統計軟件SPSS13.0進行數據處理。采用χ2檢驗用于兩兩組數據比較。

2 結果

2.1 VEGF在研究組及對照組中的蛋白表達

研究組EMT在位內膜陽性率高于異位內膜陽性率(χ2=4.19，P ＜0.05，差異有統計學意義)，同時也高于對照組正常內膜陽性率(χ2=11.57，P＜0.05，差異有統計學意義)。見表1。

表1 VEGF在EMT及對照組內膜中的表達

2.2 PEDF在研究組及對照組中的蛋白表達

研究組EMT在位內膜陽性率低于異位內膜陽性率(χ2=4.66，P ＜0.05，差異有統計學意義)，但高于對照組正常內膜陽性率(χ2=4.66，P ＜0.05，差異有統計學意義)。見表2。

表2 PEDF在EMT及對照組內膜中的表達

2.3 Ⅰ、Ⅱ期患者與Ⅲ、Ⅳ期患者組織中VEGF水平

研究組III期、IV期患者組織中VEGF的表達陽性率高于I期、II期，說明在子宮內膜異位癥患者組織中VEGF的表達水平隨疾病嚴重程度的加重而升高，差異不顯著。見表3。

表3 I、II期患者與III、IV期患者組織中VEGF水平

2.4 Ⅰ、Ⅱ期患者與Ⅲ、Ⅳ期患者組織中PEDF水平

研究組III期、IV期患者組織中PEDF的表達陽性率高于I期、II期，說明在子宮內膜異位癥患者臨床表現越重，組織中PEDF的表達水平越高，差異顯著。見表4。

表4 I、II期患者與III、IV期患者組織中PEDF水平

3 討論

3.1 VEGF的表達及在異位病灶形成中作用

本研究發現：EMT患者在對照組內膜中VEGF的表達低于在位內膜，因此提示EMT患者在位內膜，可能存在異常的生物活性，導致了較強的血管生成能力及血管增殖活性。目前認為VEGF促進血管形成機制可能有以下三方面：一方面：EMT患者的正常子宮內膜，可隨經血逆行流入腹腔，可在卵巢或腹腔其它部位形成早期微小內異癥病灶，月經周期使異位病灶周期性生長，由于新生血管基底膜缺損導致子宮內膜基底層的血液供應缺乏，造成異位病灶組織相對缺氧。缺氧可誘導內皮細胞產生缺氧誘導因子，而且VEGF是重要的靶基因，缺氧在基因水平可直接上調VEGF的表達，新生血管就這樣形成了。但是新生的血管結構不完整，容易易發生滲漏和出血，形成典型的異位病灶，大概需要6～24個月。然而新生的血管不能改善異位組織的缺氧狀態，反而誘發更多的血管生成因子，導致大量新生血管的形成，最后導致內異癥進一步的發展，病情更加嚴重。雖然異位內膜的不斷生長，但是新生血管內血液的相對不足，異位內膜組織內皮細胞的進一步缺氧，而缺氧又促進VEGF進一步的高表達，往復循環，致使異位內膜具有了惡性腫瘤強侵襲性，最后導致輸卵管黏連等一系列的并發癥。另一方面：VEGF與內皮細胞的特異性受體結合，激活內皮細胞內基因表達，使內皮細胞快速生長，使其參與血管的形成。第三方面：VEGF可以誘導內皮細胞表達MMPs等多種組織因子及組織蛋白酶，這些因子和酶都可以降解內皮細胞外基質和削弱內皮細胞基質的屏障作用，使新生血管基底膜缺損加重，缺氧加重，而異位內膜的生長又可表達更多的VEGF，進一步促進新血管的生成，導致了惡性循環。

研究結果還顯示：研究組異位內膜和對照組均低于在位內膜組織中VEGF的表達而且異位內膜組又高于對照組，說明在位內膜可時異位內膜獲得相對充分的血液供應，使異位內膜得到快速的生長，這就表明在位內膜可能具有超強的血管生成活性。同時研究還發現，異位內膜的血管生成力比在位內膜明顯減低，原因可能是在位內膜對異位內膜有一定的抑制作用，尚有待進一步研究。增生期的在位內膜VEGF的表達低于分泌期，說明內膜在分泌期具有更強的促血管生產能力及較強的侵襲活性。也說明激素可能影響VEGF的表達。VEGF在r-AFS臨床分期中，Ⅰ、Ⅱ期的表達陽性率為83.33%，Ⅲ、Ⅳ期的強度表達陽性率為93.75%，差異不大，說明VEGF與內異癥的臨床分期無顯著關系，與內異癥的病情嚴重程度關系不大。

3.2 PEDF在EMT的中表達及在EMT發生發展中的作用

色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)是1989年Tombran Tink［2］等從胎兒色素上皮培養液中，其分子量為50Kd，位于常染色體17p13.1［3］上。1999年Daw son［4］等通過實驗研究，第一次發現PEDF還具有很強的抑制血管生成的作用，而且比以往發現的抑制血管生成的因子(如內皮抑素等)還要強。目前，認為PEDF抑制新血管形成的機制有如下幾種可能：(1)在缺氧下，各種血管生成誘導因子大量表達，此時PEDF能有效的抑制內皮細胞向各種血管生成誘導劑(如溶血磷脂酸，白細胞介素 -8，PDGF，VEGF，a-FGF)移行。(2)PEDF可以促進JNK的磷酸化，血管生成基因介導的T細胞核因子的激活被阻止。另外不同的磷酸化位點，可以使PEDF發揮抗血管生成的作用，如阻止Ser24及Ser114的磷酸化，可以去除PEDF的營養神經功能，同時會加強其抗新生血管生成功能。某些研究表明：采用尾靜脈主神注射脂納米載體介導的PEDF于子宮內膜異位癥鼠模型的實驗研究結果表明：PEDF對照組的異位病灶大小明顯高于治療組(P＜0.05)，同時治療組的組織形態學出現明顯的萎縮跡象；PEDF對照組間質細胞VEGF表達顯著高于治療組(P＜0.05)；PEDF對照組異位病灶凋亡指數顯著低于治療組(P＜0.05)，結果證實PEDF抑制新生血管生成或促進異位子宮內膜細胞凋亡來實現的。

本實驗研究結果示：PEDF在異位內膜的蛋白表達陽性率高于在位內膜；正常對照組內膜低于在位內膜的陽性表達率，表明PEDF抑制新生血管生成或促進異位子宮內膜細胞凋亡來實現的。研究組增生期的在位內膜PEDF的表達與分泌期內膜無顯著差異。內異癥臨床r-AFS分期，PEDF在III-IV期高于I-II期患者，說明與內異癥的病情嚴重程度有關系。

3.3 PEDF與VEGF相關性和在內異癥發生發展中的意義

Stellmach［5］等認為，PEDF可能通過促進活化的血管內皮細胞凋亡，來抑制血管生成的。另外，Volpert［6］等研究還認為，PEDF對內皮細胞的這種作用是通過FasL-Fas受體系統來實現的。Fas是一種跨膜受體，FasL是一種跨膜蛋白，當FasL激活Fas時即可啟動細胞凋亡級聯反應，PEDF還可以上調內皮細胞FasL的表達。VEGF產生的內皮細胞與PEDF有很大的不同，此內皮細胞表達的Fas受體易受PEDF作用，因此PEDF上調FasL、Fas與FasL［8］相互作用引發內皮細胞凋亡［7］。此外還有學者研究認為，PEDF是通過VEGF的移行，來實現抑制血管的增生作用。

［1］欒宏.子宮內膜異位癥病因研究進展［J］.黑龍江醫藥科學，2004，27(3)：87 88

［2］Tombran-Tink J，Chader GG，Johnson LV.PEDF：a pigmentepithelium-derived factor with potent neuronal differentiative activity［J］.Exp Eye Res，1991，53(3)：411 414

［3］Tombran-Tink J，Pawer H，Swaroop A，et al.Localization of the gene for pigment epithelium-derived factor(PEDF)to chromosome 17p13.1 and expression in cultured human retinoblastoma cells［J］.Genomics，1994，19(2)：266 272

［4］Dawson DW ，VolpertOV ，GillisP，etal.pigmentepithelium-derived factor：a potent inhibitor of angiogenesis［J］.Science，1999，285(5425)：245 248

［5］Stellmach V，Crawford SE，Zhou W，et al.Prevention of ischemiainduced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic pigment eppithiun-derived factor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(5)：2593 2997

［6］Volpert OV，Zaichuk T，Zhou W，et al.Induer-stimulated Fas targets activated endothelium for destruction by anti-angiogenic thrombospondin-1 and pigment epithelium-derived factor［J］.Nat Med，2002，8(4)：349 357

［7］Nagata S，Golstein P.The Fas death factor［J］.Science，1995，167(523)：1449 1452

［8］王君，盧北燕，胡玉紅.子宮內膜異位癥與細胞凋亡關系的研究進展［J］.黑龍江醫藥科學，2008，31(2)：69 70