加熱后低溫放置對美拉德反應特征顏色和抗氧化性的影響

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(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

加熱后低溫放置對美拉德反應特征顏色和抗氧化性的影響

張莎莎,景浩*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

為分析短時加熱與低溫相結合對美拉德反應顏色特征、抗氧化性和反應進程的影響,利用木糖與甘氨酸模式美拉德反應體系,在60℃預加熱0、0.5、1h后,置于4℃條件下觀測反應變化。通過吸光值和色差的測定、紫外可見吸收光譜的分析、ABTS及DPPH自由基清除率的變化反應體系特征顏色和抗氧化性的變化。結果表明,60℃加熱時間越長,木糖-甘氨酸美拉德反應體系的初始吸光值、b值和自由基清除率越大且變化幅度較快,而初始L值和a值則越小。在4℃下放置,反應體系的吸光值均隨著反應時間的延長呈現上升趨勢；L、a、b值均呈現下降趨勢；加熱0和0.5h的反應體系在紫外區265nm處出現特征峰,而加熱1h的體系無此特征峰出現,不同體系在可見光區均在580nm和630nm處出現特征峰,且隨著反應時間的增加吸光強度不斷增大；ABTS、DPPH自由基清除率均隨著反應時間的延長呈現上升趨勢,但ABTS自由基清除率的增加較明顯,而DPPH自由基清除能力增加較平緩。

木糖,甘氨酸,美拉德反應,短時加熱,低溫反應

美拉德反應(Maillard Reaction,MR)又稱羰氨反應,主要發生在含有羰基和含有氨基的化合物中,是食品色澤和風味的主要來源[1]。但是食品基質一般較復雜,且發生美拉德反應后所生成的產物也比較復雜,故常用含有羰基的糖和含有氨基的氨基酸建立模式美拉德反應體系來進行研究[2],單一模式的美拉德反應的整個反應進程受糖和氨基酸的種類、糖和氨基酸的比例、pH、加熱溫度、緩沖液、反應時間、溶劑等因素的影響,已有很多研究證實溫度和時間的變化對美拉德反應的影響最重要,隨著溫度的升高,美拉德反應的速率也將隨之增加[3]。美拉德反應生成類黑精一般需要經歷三個不同的階段：初級、中級和終級三個階段,而中級階段的還原酮路線,Osulose路線和Strecker路線三個不同的途徑產生的中間產物是生成大分子類黑精不可或缺的步驟[4],也是特征色產生的關鍵步驟。根據Murakami等[5]的報道可知在美拉德反應初期木糖-甘氨酸生成了藍色物質,木糖-組氨酸生成了黃色物質、木糖-精氨酸生成了紅色物質,隨著反應的進行,這些藍色、黃色和紅色物質會進一步反應生成棕褐色物質。孫倩等[6]報道了,木糖-甘氨酸美拉德反應體系在60℃下便會在較短時間內由藍色迅速轉變為綠色。尹姿等[7]報道,木糖-甘氨酸美拉德反應體系在30℃下加熱48h,便會生成藍色產物。張莎莎等[8]報道,木糖-甘氨酸美拉德反應體系在4℃下放置15d,在第6d轉變為淡藍色,隨著反應時間的延長,反應體系的藍色逐漸加深,直至15d時變成深藍色。綜合上述報道可知,不同溫度下生成特征色所需要的時間和反應進程都有一定的差異。為了控制美拉德反應的進程,研究美拉德反應特征色的生成過程,本研究將60℃加熱和4℃低溫放置兩種溫度條件結合,在60℃加熱0、0.5、1h后,然后置于4℃條件下避光進行反應,從而來研究復合溫度條件對木糖-甘氨酸美拉德反應體系特征性藍色生成和抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

D-木糖(D-xylose,MW150.13,含量98.5%) 購于北京嘉康源科技發展有限公司；L-甘氨酸(L-glycine,MW75.07,含量大于99%) 購于天津華陽生物科技有限公司；碳酸氫鈉(NaHCO3,MW84.01)、乙醇(Ethanol,EtOH,純度≥95%) 均購于北京化工廠；2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2′2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH) 均購于美國Sigma 公司。

XB 220A電子天平 Precisa Gravimetrics AG；QL-901渦流振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;pHS-3C+酸度計 成都市紀方舟科技有限公司；ADCI系列全自動色差計 北京辰泰克儀器技術有限公司；Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司；UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 美拉德反應體系溶液的制備 木糖-甘氨酸美拉德反應體系中各物質的最終摩爾濃度為：木糖1mol/L,甘氨酸0.33mol/L,NaHCO30.05mol/L,加入乙醇的體積占反應體系總體積的20%,用8mol/L的HCl溶液將體系pH調至7.5；將配制好的反應體系分成3等份,分別在60℃條件下預先加熱0、0.5、1h后,將預處理后的三個體系置于4℃條件下反應15d,每隔3d取樣一次,樣品置于-20℃冰箱中待用。

1.2.2 吸光值和顏色的測定 取各樣品原溶液300μL到96孔板中,用酶標儀分別在450、570、630nm下測吸光值；用UV-1200型紫外分光光度計對樣品液從200～700nm進行紫外可見光譜掃描,為保證讀數在合適的范圍內,可以將反應物稀釋一定倍數。

用ADCI-60-C型全自動色差儀測定樣品溶液Lab色差值的變化,其中L表示從0(黑色)至100(白色)范圍內樣品的亮度；根據色差計的設定,a值表示從-128(綠色)至+127(紅色)范圍內樣品的顏色；b值表示從-128(藍色)至+127(黃色)范圍內樣品的顏色。色差儀先預熱30min,用標準黑板校準黑色后,蓋上標準白板校準白色,測定時取5mL樣品原液于玻璃皿中,每個樣品測3次,記錄L、a、b值。

1.2.3 ABTS自由基清除率測定 參照尹姿等[7]的方法。簡述如下,將0.5mL 14mmol/L ABTS和0.5mL 4.9mmol/L過硫酸鉀混合,使ABTS和過硫酸鉀的終濃度分別為7mmol/L和2.45mmol/L?；旌先芤涸谑覝?、避光條件下靜置過夜,形成ABTS工作液,在使用前用PBS緩沖液稀釋(15～30倍),使其在630nm波長下的吸光值為0.50±0.02,形成ABTS工作液。在96孔板中進行ABTS自由基清除實驗。在樣品孔中加入10μL樣品、90μL ABTS自由基溶液(Abs樣品),在顏色對照孔中加入10μL樣品、90μL PBS緩沖液作為樣品顏色對照(Abs對照),在空白對照孔中加入10μL PBS、90μL ABTS工作液(Abs空白)。在黑暗室溫環境下放置8min,在630nm波長下讀取吸光值(Abs),帶入下式計算：

ABTS自由基清除率(%)=[Abs空白-(Abs樣品-Abs對照)]/Abs空白×100

1.2.4 DPPH自由基清除率測定 參照李琦[9]測定的方法并稍作修改。簡述如下,稱取9.8mg DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶于10mL無水乙醇中,配制成濃度為25μmol/L的儲備液,使用前用無水乙醇稀釋儲備液至濃度為1.56μmol/L的工作液。在96孔板中進行DPPH自由基清除實驗。在樣品孔中加入15μL樣品、60μL Tris-HCl 和150μL DPPH工作液(Abs樣品),在顏色對照孔中加入15μL樣品、60μL Tris-HCl和150μL無水乙醇(Abs對照),在空白對照孔中加入15μL無水乙醇、60μL Tris-HCl和150μL DPPH工作液(Abs空白)。在黑暗室溫環境下放置30min,在520nm波長下讀取吸光值(Abs),帶入下式計算：

DPPH自由基清除率(%)=[Abs空白-(Abs樣品-Abs對照)]/Abs空白×100

1.2.5 數據處理方法 數據的顯著性差異由Minitab軟件進行分析。對均數進行單因素方差分析(One way analysis of variance,One way ANOVA),進一步以Tukey多重比較進行檢驗,得到各組均數間的顯著性差異(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1木糖-甘氨酸美拉德反應體系紫外光譜掃描

由圖1可知,在200～400nm的紫外光區,60℃加熱0和0.5h的木糖-甘氨酸美拉德反應體系在整個反應過程中均在265nm處出現特征峰,而60℃加熱1h的反應體系并無此特征峰出現。60℃加熱0h的體系在4℃下放置第3d在265nm處出現明顯的特征峰,且隨著反應時間的增加,吸光強度逐漸呈現上升趨勢；60℃加熱0.5h的體系在加熱完成時即在265nm處出現了明顯的特征峰,隨著反應進行至第6d時,特征峰消失；而60℃加熱1h的體系從加熱結束至4℃放置的整個反應過程中都未在265nm處出現特征峰。根據Jing等[3]的報道可知,在265nm處容易出現α-二羰基化合物,結合色差的變化,60℃加熱0.5h的體系,4℃放置反應至第9d和60℃加熱1h的體系沒有明顯的藍色產生,我們可推知：265nm處的α-二羰基化合物可能是生成藍色物質的主要前體物質。

圖1 Xyl-Gly MR體系的紫外光譜

2.2木糖-甘氨酸美拉德反應體系可見光譜掃描

由圖2可知,在400～700nm的可見光區,60℃加熱不同時間的木糖-甘氨酸美拉德反應體系均在580nm和630nm處出現特征峰,隨著反應時間的延長,吸光強度均增加。60℃加熱0h的體系在4℃下放置至第9d時出現明顯的特征峰,60℃加熱0.5h的體系4℃下僅放置3d便有特征峰出現,而60℃加熱1h體系加熱完成后便有特征峰出現。60℃加熱時間越長,特征峰出現時間越早,且在4℃下放置的0～15d內,隨著反應時間的延長,反應體系的吸光強度上升越快。有報道木糖-甘氨酸美拉德反應體系的顏色特征物主要出現在580nm和625nm處[10],我們檢測的顏色特征峰出現在580nm和630nm處,主要是由于環境或檢測儀器的略微不同所致。根據400～700nm可見光區的光譜掃描結果,同時結合色差和吸光值的變化,可推知：60℃加熱能明顯促進低溫反應的進行。

圖2 Xyl-Gly MR體系的可見光譜

2.3木糖-甘氨酸美拉德反應體系吸光值的變化

由圖3可知,木糖-甘氨酸美拉德反應體系在60℃加熱時間越長,初始吸光值越大。4℃下放置,在0～15d內,隨著4℃放置時間的延長,三個體系在450、570、630nm處的吸光值均呈現上升趨勢,上升幅度依次為：1h>0.5h>0h。60℃加熱時間越長吸光值的變化越快,但當反應體系的吸光值高達2.5以上時,反應體系的顏色過深可能致使在任何波長下都有較高的吸光值,并不能代表特征色的變化。根據Mruia等[11]和Murakami等[5]的綜合報道可得出：627nm處有明顯的特征峰,經分離鑒定可知此處產生的為藍色物質。由于儀器的略微差異,630nm為藍色物質特征峰,同時根據圖3中630nm處木糖-甘氨酸美拉德反應體系吸光值的變化發現,60℃加熱0.5h體系僅在4℃條件下放置3d的吸光值和60℃加熱0h體系在4℃下放置12d的吸光值相差無幾,而60℃加熱1h后的吸光值已較大。450nm的吸光值常用來判斷美拉德反應的褐變程度[12],450nm處吸光值的不斷增大可判斷整個體系的褐變程度不斷的增強。綜合450、570和630nm處吸光值的變化可推知,加熱能明顯促進低溫反應的發生和進行。

圖3 Xyl-Gly MR體系的吸光值變化

2.4木糖-甘氨酸美拉德反應體系顏色的變化

由表1可知,木糖-甘氨酸美拉德反應體系在60℃加熱的1h內,隨著加熱時間的延長,L、a值均迅速降低，b值呈升高趨勢。60℃分別加熱0、0.5、1h的體系,在4℃下放置的0～15d內,L、a、b值也均隨著反應時間的延長呈現下降趨勢,加熱時間越長的體系在4℃下放置時色差值下降的越快。根據肉眼觀察,60℃加熱0h的體系,4℃下放置,反應第6d出現淡藍色,隨著反應時間的延長,藍色逐漸加深；60℃加熱0.5h體系,加熱結束后,反應體系呈現淡藍綠色,4℃下放置,反應進行至第3d便呈現深藍色,隨著反應時間的延長,反應體系的顏色逐漸加深,反應進行至第9d時肉眼觀察呈現黑色,可能是由于反應體系顏色較深,才導致用色差儀檢測時光線無法返回,致使無數值呈現；60℃加熱1h體系,加熱完成后,反應體系呈現綠色,4℃下放置,隨著反應時間的延長,反應體系的顏色越來越深?？傮w而言,由L、a、b值變化和下降程度的不同可推知：60℃加熱促進了木糖-甘氨酸美拉德反應體系的發生和進行,但加熱時間過長可能導致反應體系顏色變化過快,且顏色較深,無法得到所需要的特征藍色。

表1 Xyl-Gly MR體系的色差變化

注：數值=平均值±標準差,見1.2.5。上標字母a～d的不同表示同一行不同反應時間有顯著性差異；而上標字母A～C的不同則表示同一列不同時間有顯著性差異(p<0.05)。 -無數值,推測可能是由于反應體系的顏色過深,導致光線無法返回,故無數值呈現。

2.5木糖-甘氨酸美拉德反應體系ABTS/DPPH自由基清除率

由圖4可知,60℃加熱時間越長,反應體系的起始自由基清除能力越大。結合色差和吸光值的變化,可推知反應體系的顏色越深,ABTS自由基清除能力越強。將反應溶液稀釋15倍后,整個反應體系仍具有很高的ABTS自由基清除率,這和張凌燕等[2]的報道結果相一致。60℃加熱0、0.5、1h后,4℃下放置15d,三個體系的ABTS自由基清除率呈緩慢上升趨勢,具體變化趨勢為1h加熱組>0.5h加熱組>0h未加熱組。未加熱(0h)和加熱(0.5、1h)組的初始DPPH自由基清除率有明顯的差異,但隨著反應的進行,未加熱組DPPH自由基清除率逐漸增加,在15d時與加熱組接近同一水平。4℃下放置15d,加熱組DPPH自由基清除率無明顯的變化。由此可知,同一反應體系ABTS和DPPH自由基清除率差異的出現,可能與兩者本身的清除原理不同有必然的聯系。

圖4 Xyl-Gly MR體系的ABTS/DPPH自由基清除能力變化

3 結論

本實驗通過比較木糖-甘氨酸美拉德反應體系在60℃下分別加熱0、0.5、1h后的變化,證實60℃加熱較短時間可以促進4℃低溫反應的進行,但是加熱時間過長,由于溫度過高,反應速率過快,可能跨越特征色產物的生成過程。整體而言,60℃加熱后在4℃下放置,隨著反應時間的延長,各個反應體系的顏色逐漸加深,且60℃加熱0h的體系較加熱0.5和1h的體系顏色鮮亮些,結合各個指標可知：60℃加熱0h的體系在反應進行至12d時產生最優的亮藍色,而60℃加熱0.5h體系明顯縮短產生藍色的時間,在反應進行至3d時便產生藍色,但60℃加熱1h的體系卻沒有明顯的藍色生成。該實驗結果同時進一步證實了反應體系的顏色越深ABTS自由基清除率越高,而DPPH自由清除率在顏色較深時變化不大,這可能與兩者自由基清除原理不同有關。結合200～400nm紫外光譜掃描結果推知：265nm處物質的存在與否可能與藍色物質的生成有一定的關系,但仍須進一步研究。在以后的研究中可進一步研究反應初期不同物質的產生和特征色物質產生的相互關系。本文研究結果對于美拉德反應產物的制備具有一定的參考價值。

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Effect of two phases of high and low temperatures on characteristic color development and antioxidant activity in Maillard reaction system

ZHANGSha-sha,JINGHao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Characteristic color development and free radical scavenging activity in Xyl-Gly Maillard reaction system was investigated under two phases of high and low temperatures. The Xyl-Gly Maillard reaction system was heated at 60℃ for 0,0.5,1h and then set at 4℃ for 15d. The results showed that,the longer time heated at 60℃,the greater initial values of absorbance,b and free radical scavenging rates. The absorbance intensity gradually increased,and the color values of L,a,b all decreased during 15d at 4℃. The characteristic peaks at 265,580 and 630nm appeared on the UV-Vis,with increased absorbance intensity at 580 and 630nm and disappearance of the peaks at 265nm. ABTS and DPPH radical scavenging rates increased with increasing time at 4℃. Preheating could promote the Maillard reaction in low temperature,but the characteristic peak at 265nm disappeared as heating temperature increased.

xylose;glycine;Maillard reaction;short time heated;low temperature reaction

2013-06-17 *通訊聯系人

張莎莎(1989-)，女，碩士，研究方向：美拉德藍色反應產物的制備技術。

“十二五”農村領域國家科技計劃課題子課題(2011BAD23B02)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0061-05