不同組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對人肺癌細胞A549作用的研究

,，*,, ,

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088； 2.旭駿水產(湛江)有限公司,廣東湛江 524057)

不同組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對人肺癌細胞A549作用的研究

蔡璐1,王維民1，*,諶素華1,丁偉2,李春蓮1

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088； 2.旭駿水產(湛江)有限公司,廣東湛江 524057)

本研究采用不同組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯(SF)對人肺癌細胞A549細胞的抑制作用進行了研究。根據MTT比色法檢測不同細胞鋪板數量及不同質量濃度SF對該細胞生長曲線的影響；不同組分SF在不同時間對該細胞的增殖抑制率；倒置顯微鏡下觀察SF對該細胞形態的影響。研究結果表明,當SF的濃度在1～25mg/mL范圍、細胞鋪板數量為5×103個/mL時,細胞生長曲線線性良好；各組分SF對人肺癌細胞A549均有抑制作用,其中SF2-R對細胞的抑制效果較強,抑制率為61.06%。

馬尾藻巖藻聚糖,人肺癌細胞A549,抑制效果,鋪板

馬尾藻(Sargassumsiliquastrum)是褐藻的一屬,墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬。巖藻聚糖硫酸酯(Fuciodan)是海藻多糖中一類獨特的結合有硫酸基團的活性多糖,具有顯著的抗腫瘤[1-2]、抗病毒[3-4]、提高免疫力[5]、降血脂[6-7]、抗凝血[8]等活性。但由于其分子量大,溶解性較差,不容易被人體吸收,所以在研究和應用方面受到了限制。因此研究低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的制備及其活性為巖藻聚糖的應用開拓了新的途徑。目前關于海帶[9](Laminaria)、裙帶菜[10](Undariapinnatifida)、鼠尾藻[11](Sargassum.thunbergii)等褐藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯的抗腫瘤活性已經有了很多的研究報道,但是對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯尤其是低分子量的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的研究很少。本文以馬尾藻為原料提取SF,經分解得到不同分子量的組分,研究不同組分SF對人肺癌細胞A549的抑制作用,希望能夠將SF作為對肺癌進行抑制的功能性食品提供依據,并為馬尾藻的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

馬尾藻 2012年4月采自湛江硇州島；不同分子量的SF 由本實驗室提取、分離純化及降解所得8個組分,其相對平均分子量及硫酸根含量如下：SF1(851.13ku,30.93%)、SF2(239.05ku,32.65%)、SF3(102.34ku,29.88%)、SF4(19.95ku,21.61%)、SF1-R(53.74ku,33.63%)、SF2-R(19.54ku,35.87%)、SF3-R(9.27ku,30.44%)、SF4-R(6.69ku,20.85%)。

細胞株：人肺癌細胞A549 購于中國科學院上海生命院細胞資源中心；RPMI-1640培養基 美國GIBCO公司產品；胰蛋白酶Trypsin 美國GIBCO公司產品；噻唑藍(MTT) 美國Amresco公司產品；青霉素G鈉鹽 美國Amresco公司產品；硫酸鏈霉素 美國Amresco公司產品；優級胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司生產；二甲基亞砜DMSO 美國Amresco公司產品；PBS緩沖液(pH7.2～7.4) 北京鼎國生物技術有限公司。

SHELL/JB TC2323型CO2培養箱 美國殼牌公司；BHC-1300ⅡA/B3型超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；TE300型倒置顯微鏡 NIKEO ECLIPSE公司；BIO-ELX808型全自動酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；TG16A-WS型離心機 上海離心機儀器有限公司；液氮罐 成都云光低溫科技有限責任公司；Thermo超低溫冰箱 廣州市凌志電子科技有限公司；高壓滅菌鍋 上海比朗儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱 天津市達北實驗儀器廠；AUW120型電子分析天平 日本島津；PHS-3C精密pH計 上海雷磁。

1.2實驗方法

1.2.1 腫瘤細胞的培養 將肺癌細胞A549以RPMI-1640為培養液(含10%小牛血清、青霉素100U/L、鏈霉素100μg/L),在5% CO2培養箱中培養,以0.25%的胰蛋白酶消化,取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 腫瘤細胞鋪板數量的確定 以細胞計數法建立肺癌細胞A549的生長曲線,將生長良好的細胞制成細胞懸液,按1×103～1×105個/mL 180μL接種到培養板各孔中,每個濃度設3個復孔,于37℃、5%的CO2培養箱中分別培養24、48、72、96h后加入20μL MTT溶液,繼續培養4h后棄培養液加入150μL DMSO,振蕩10min,490nm測OD值。以培養時間(h)為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制細胞生長曲線,對比不同鋪板數量的細胞隨培養時間的生長曲線的線性情況。

1.2.3 多糖對腫瘤細胞抑制作用的濃度確定 研究一系列不同質量濃度(0、0.1、0.5、1、2、4、8、10、15、20、25、30mg/mL)的多糖對肺癌細胞A549增殖的抑制情況。以MTT法測定SF1對細胞作用48h后細胞數量反應的OD值與濃度之間的關系。

1.2.4 MTT比色法測定各組分SF對腫瘤細胞增殖的影響 參照文獻[12]將生長情況良好的肺癌細胞A549濃度調整為5×103個/mL,每孔180 μL接種于96孔板上,每孔設置3個復孔,同時設對照孔和空白孔,在37℃、5% CO2孵箱中培養24h；在96孔板中每孔加入20uL用RPMI-1640培養基配制的不同質量濃度的多糖溶液,使多糖的最終濃度調整為1、2.5、5、10、20mg/mL的,在對照組和空白組加入20μL的RPMI-1640培養基；使多糖溶液作用的時間分別為24、48、72h,作用時間結束后,倒掉上清液,用PBS洗滌2次；每孔加入用濾器過濾的MTT 20μL,在37℃、5% CO2培養箱中繼續培養4h,小心吸除上清液,每孔加入150μL DMSO,將96孔板在酶標儀上振蕩10min,490nm處檢測吸收值,計算：

增殖抑制率(%)=1-(處理組平均OD值-空白對照組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白對照組平均OD值)×100。

按改良Karber公式計算半數抑制率(IC50)：

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)[13]

式中符號意義：Xm：lg最大劑量,I：lg(最大劑量/相臨劑量),P：陽性反應率之和,Pm：最大陽性反應率,Pn：最小陽性反應率。

2 結果與分析

2.1腫瘤細胞鋪板數量的確定

將貼壁細胞A549按每孔細胞數量在1×103～1.0×105個/mL的范圍鋪板,繪制OD值與時間關系曲線,如圖1,當細胞數量以5×103個/mL鋪板時,細胞數量反應的OD值與時間呈良好的線性關系(R=0.996)。當鋪板細胞數少于1×103個/mL時,結果重復性不好；當細胞數量在5×104個/mL時,在72h出現平臺期,細胞數量所反應的OD值與時間的線性相關性不好。為了排除細胞數量對實驗結果的影響,對于肺癌細胞A549的后期實驗宜選取5×103個/mL為鋪板數量。

圖1 不同接種數量的肺癌細胞A549的生長曲線

2.2 SF對腫瘤細胞抑制作用濃度確定

結果如圖2所示,與空白對照管比較,當SF1濃度小于0.5mg/mL時測得的OD值與空白對照管OD接近,細胞增殖抑制作用不明顯。當SF1濃度大于1mg/mL時,細胞增殖被抑制,并且隨著SF1濃度的升高,細胞增殖抑制作用逐漸加劇。當SF1濃度到達25mg/mL,細胞增殖抑制達到極限,繼續增加SF1濃度,細胞增殖的抑制情況變化不明顯。綜合實驗結果分析,硫酸酯多糖的濃度在1～25mg/mL范圍內,對腫瘤細胞具有良好的抑制趨勢,在后期實驗中選取0(對照)、1.25、2.5、5、10、20mg/mL濃度進行研究。

2.3各SF組分對腫瘤細胞增殖的影響

時間(h)濃度(mg/mL)SF1SF1-RSF2SF2-ROD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)2400.567±0.0061.250.542±0.009*4.070.549±0.006**3.170.541±0.007**4.580.529±0.008**6.702.50.528±0.012**6.550.526±0.006**7.230.514±0.007**9.350.506±0.006**10.7650.495±0.019**12.390.482±0.013**14.990.485±0.015**14.460.467±0.009**#17.64100.488±0.009**13.630.472±0.004**16.750.470±0.015**17.110.446±0.009**##21.34200.481±0.017**15.610.464±0.007**18.170.456±0.005**19.580.423±0.013**##25.404800.768±0.0191.250.731±0.034**4.280.714±0.032**#7.030.717±0.009**6.640.704±0.014**8.332.50.698±0.005**9.110.682±0.005**#11.200.686±0.013**10.680.668±0.012**##13.0250.652±0.005**15.100.630±0.018**##17.980.646±0.010**15.880.615±0.006**#19.92100.609±0.011**20.700.583±0.025**##24.220.594±0.008**22.660.575±0.007**25.13200.542±0.012**29.430.518±0.015**##32.550.524±0.008**31.770.496±0.006**#35.427200.945±0.0161.250.853±0.014**9.770.869±0.013**8.040.841±0.008**11.010.826±0.015**#12.592.50.795±0.014**15.870.774±0.007**#18.180.782±0.005**17.250.762±0.006**#19.3750.690±0.017**26.980.647±0.008**##31.530.684±0.006**27.620.614±0.016**##35.03100.582±0.007**38.410.520±0.011**##44.970.564±0.017**40.310.493±0.012**##47.83200.451±0.008**47.720.398±0.009**##57.880.427±0.013**54.810.368±0.008**##61.06

注釋：降解前多糖組分與對照組比較：*p<0.05,**p<0.01；同濃度,同時間下降解后多糖組分與降解前多糖組分比較：#p<0.05,##p<0.01，表2同。

時間(h)濃度(mg/mL)SF3SF3-RSF4SF4-ROD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)OD值IR(%)2400.567±0.0061.250.555±0.0112.120.549±0.0113.170.557±0.0101.760.547±0.007*3.532.50.543±0.013*4.230.530±0.017**6.530.547±0.008*3.530.542±0.013**4.4150.505±0.014**10.930.502±0.005**11.460.531±0.072**6.350.529±0.005**6.70100.492±0.005**13.230.482±0.012**14.990.513±0.011**9.520.508±0.004**10.41200.485±0.006**14.460.479±0.018**15.520.496±0.004**12.520.501±0.009**11.644800.768±0.0191.250.739±0.016*3.780.728±0.015**5.210.745±0.018*2.990.750±0.010*2.302.50.724±0.005**5.730.707±0.004**#7.940.730±0.013**4.950.732±0.004**4.4950.679±0.009**11.590.667±0.006**13.150.703±0.025**8.460.72±0.002**#6.12100.638±0.010**16.930.607±0.015**##20.960.682±0.015**11.210.686±0.006**10.63200.584±0.012**23.960.571±0.005**25.650.643±0.014**16.280.641±0.010**16.547200.945±0.0161.250.896±0.036**5.190.877±0.014**#7.200.894±0.031*5.360.899±0.016**4.872.50.823±0.005**12.490.798±0.033**##15.560.870±0.016**7.940.878±0.012**7.0950.729±0.007**22.860.689±0.029**##27.090.812±0.010**14.070.831±0.021**12.06100.647±0.016**31.530.627±0.014**##33.650.746±0.015**21.060.768±0.014**18.73200.574±0.027**39.260.523±0.036**##44.660.684±0.029**27.620.693±0.012**26.67

MTT結果分析如表1、表2所示,不同質量濃度的各組分SF對肺癌細胞A549作用不同時間后,細胞受到不同程度的抑制,而且不同時間、不同濃度的作用效果具有顯著性差異。相同作用時間下,隨著SF質量濃度的增大,細胞增殖的抑制率逐漸升高,而在同一濃度水平,隨著作用時間的延長,各組分SF對A549細胞的生長抑制作用也呈現逐漸增大的趨勢,可以看出各組分SF對肺癌細胞A549增殖的抑制作用呈現明顯的量效和時效關系。

表3 各SF組分對肺癌細胞A549作用不同時間的IC50值

圖2 肺癌細胞A549在不同濃度SF1作用下的生長曲線

采用統計學分析(p<0.05顯著,p<0.01極顯著),8個組分SF對肺癌細胞A549作用的實驗組與陰性對照組的比較,結果分析表明：除1.25mg/mL組的SF3、SF3-R、SF4對細胞作用24h時的抑制作用無統計學意義外(p>0.05),其余組與陰性對照組比較差異均有統計學意義(p<0.05顯著,p<0.01極顯著)。在相同時間、相同濃度下,統計學分析酶降解后的4個組分SF與其各自降解前組分對肺癌細胞A549的抑制作用結果表明：在48～72h,SF1-R、SF2-R相較于SF1、SF2對A549細胞增殖抑制作用差異顯著(p<0.05顯著,p<0.01極顯著),在24h,個別濃度的SF2-R相較于SF2對細胞增殖抑制作用差異顯著；在作用72h時,SF3-R相較于SF3對A549細胞抑制作用差異顯著(p<0.05顯著,p<0.01極顯著),而在作用24、48h時只有個別濃度的SF3-R對A549細胞增殖的抑制作用相較于SF3差異顯著；SF4-R相較于SF4作用差異不顯著(p>0.05),具體結果分析如表1、表2。其中SF2-R對肺癌細胞A549作用72h時的抑制作用最明顯,抑制率達到61.06%,而SF4和SF4-R抑制作用接近且最低。這主要與各組分馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的理化組成及分子量的大小有關,海藻多糖的生物活性是在一定的分子量范圍體現出來的,分子量太大、太小都會影響其生物活性。在一定分子量范圍,經酶降解的高分子量的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的活性被提高,但是分子量太低其活性也受到抑制。另外,活性硫酸基團越多活性表現也越明顯。

2.4 SF對腫瘤細胞的IC50值

各組分SF對肺癌細胞A549增殖均有一定的抑制作用,而且不同濃度,不同作用時間對肺癌細胞A549抑制效果不同。通過抑制率對各組分SF濃度回歸方程計算在24、48、72 h不同時間組8個組分SF對肺癌細胞A549的IC50值如表3。作用72h時,SF2-R對A549的IC50達到8.75mg/mL,低于其他SF組分對肺癌細胞A549的IC50。

3 結論

本文研究了不同細胞鋪板數量及不同質量濃度的SF對肺癌細胞A549生長曲線的影響,結果表明肺癌細胞A549鋪板數量在5×103個/mL時的OD值與時間的線性關系較好,當SF的濃度為1～25mg/mL范圍時,細胞增殖抑制作用隨著SF濃度的增加而增加；由MTT實驗結果分析,各組分SF對肺癌細胞A549均有一定的抑制作用,而且呈現一定的劑量和時間依賴性；通過各組分SF對腫瘤細胞作用72h的抑制作用比較,SF2-R表現出最強的抑制作用,抑制率達61.06%,SF4-R對肺癌細胞A549的抑制作用最弱,抑制率只有26.67%；通過抑制率對SF濃度的回歸方程計算,得出各組分對肺癌細胞A549作用72h的IC50值分別為：11.64、9.86、10.63、8.75、14.37、12.62、18.71、20.27mg/mL。

[1]張珣,王靜鳳,徐雷,等.海地瓜和冰島刺參海參巖藻聚糖硫酸酯抗腫瘤作用的比較研究[J].食品科學,2012,33(7):251-255.

[2]Stanislav D,Anastyuk,Natalia M. Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens and its low-molecular fragments,structurally characterized by tandem mass-spectrometry[J]. Carbohydrate Polymers,2012(87):186-194.

[3]Zhu W,Chiu L,Ooi V,etal. Antiviral property and mode of action of a sulphated polysaccharide from Sargassum patens against herpes simplex virus type[J]. International Journal of Antimicrobial Agents,2004,24(3):279-283.

[4]Jiao G,Yu G,Zhang J,etal. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine alga[J]. Marine Drugs,2011(9):196-223.

[5]劉憲麗,劉東穎,汪艷秋,等.褐藻多糖硫酸酯免疫調節和抗腫瘤活性研究[J].中國微生態學雜志,2010,22(12):1074-1076.

[6]諶素華,王維民.馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯純化及降血脂功能研究[J].食品與發酵工業,2010,36(5):28-31.

[7]李德遠,徐戰,黃利民，等.海帶巖藻糖膠對大鼠飲食性高血脂癥的影響[J].食品科學,2001,22(2)92-95.

[8]趙雪.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學組成及活性的研究[D].青島:中國海洋大學,2004.

[9]史大華,劉瑋煒,劉永江，等.低分子量海帶巖藻多糖的制備及其抗腫瘤活性研究[J].時珍國醫國藥,2012,23(1):53-55.

[10]劉憲麗,劉東穎,汪艷秋,等.褐藻多糖硫酸酯免疫調節和抗腫瘤活性研究[J].中國微生態學雜志,2010,22(12):1074-1076.

[11]Zhuang C,Itoh H,Mizuno T,etal. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed,Umitoranoo(Sargassum thunbergii)[J]. Biosci Biotech BioChem,1995,59:563-567.

[12]林董,何愛明,吳麗萍，等.MTT法測定8種中草藥體外抗肝癌細胞SMMC-7721活性[J]. 安徽農業科學,2009,37(34):17264-17266.

[13]葉啟翔.青蒿琥酯對K562細胞端粒酶活性的影響及凋亡的作用[D].湛江:廣東醫學院,2007.

Effect of different components of fucoidan fromSargassumsiliquastrumon Lung Cancer A549 Cells

CAILu1,WANGWei-min1，*,CHENSu-hua1,DINGWei2,LIChun-lian1

(1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Xujun Aquatic Products Limited Company,Zhanjiang 524051,China)

In this study,the effect of sargasso fucosan sulfate(SF)with different components on inhibition of human lung cancer A549 cells was studied. The effect of different cell counts in the planking and SF with different concentrations on cell growth curve was detected according to the MTT assay;the proliferation inhibition rate of SF with different components on this cell at different times;the effect of SF on morphology of this cell was observed under an inverted microscope. The results showed that,when concentration of SF was set in the range of 1～25mg/mL,cell count in the planking was 5×103cell/mL,the cell growth curve had a good linearity;SF with different components all had inhibitory effect on human lung cancer A549 cells,in which SF2-R had the strongest inhibitory effect on the cells,and the inhibition rate was 61.06%.

fucoidan fromSargassumsiliquastrum;Lung Cancer A549 Cells;inhibitory effect;planking

2013-04-22 *通訊聯系人

蔡璐(1989-)，女，碩士在讀，研究方向：食品加工與貯藏。

廣東省科技計劃項目(2011B20310010)。

TS254.9

：A

：1002-0306(2014)01-0116-05