真菌黃曲霉對氟磺胺草醚的最佳降解條件研究

,,*, , , ,,

(1.東北農業大學理學院,黑龍江哈爾濱 150030； 2.東北農業大學農學院,黑龍江哈爾濱 150030)

真菌黃曲霉對氟磺胺草醚的最佳降解條件研究

崔文娟1,鄒月利1,*,陶波2,*,孫寧1,趙迪1,朱美華1,張如如1

(1.東北農業大學理學院,黑龍江哈爾濱 150030； 2.東北農業大學農學院,黑龍江哈爾濱 150030)

采用高效液相色譜法測定真菌黃曲霉在不同條件下對氟磺胺草醚的降解效率,確立降解菌株黃曲霉(TZ1985)對氟磺胺草醚的最佳降解條件。結果表明：在不調節反應液pH條件下,當氟磺胺草醚的濃度為10mg/L、黃曲霉接種量為3%的菌懸母液、溫度為25℃、振蕩培養5d時,真菌黃曲霉菌株可以降解92.5%以上的氟磺胺草醚。

氟磺胺草醚,黃曲霉,液相色譜,降解條件

氟磺胺草醚(Fomesafen)又稱虎威,是由英國捷利康公司開發的二苯醚類除草劑。化學名稱為:5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-N-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰胺[1-2]；氟磺胺草醚為無色晶體,是一種具有高度選擇性的大豆、花生田苗后除草劑,能有效地防除大豆、花生田闊葉雜草和香附子,對禾本科雜草也有一定的防效[3]。氟磺胺草醚在土壤中持效期長,用藥量偏高,對第二年種植敏感作物,如白菜、谷子、高粱、甜菜、玉米、小米、亞麻等均有不同程度藥害；極大地限制了大豆和花生產區合理的作物輪作,嚴重影響種植結構的調整,對農業生產造成極大的損失[4-6]。除草劑在土壤中主要通過光解、水解、微生物降解等降解方式,其中微生物降解起著非常重要的作用。環境的pH、溫度、濕度和土壤中的礦物質等均能影響微生物降解除草劑的除草活性[7-8]。近些年人們通過篩選和富集,分離得到的能夠降解氟磺胺草醚的微生物主要是曲霉屬和酵母屬真菌、芽孢桿菌屬細菌和鏈霉屬放線菌[9-11]。國內外研究表明,微生物降解除草劑對環境安全、無毒,尤其是在水和土壤環境中降解效果十分顯著[12-13]。實驗利用科研室篩選出能夠高效降解氟磺胺草醚的真菌黃曲霉(Aspergillusflavus)對在不同培養條件下的氟磺胺草醚除草劑降解特性進行深入的研究,利用高效液相色譜法定量檢測,確定真菌黃曲霉對氟磺胺草醚除草劑的最佳降解條件,為生物治理該類除草劑的殘留提供有效途徑[14-15]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

甲醇 美國迪馬公司；二氯甲烷 科密歐公司,均為色譜純；氟磺胺草醚標準品 購自江蘇常青農藥有限公司,其純度為98.0%；真菌黃曲霉(Aspergillusflavus) 為東北農業大學農藥學與雜草學教研室自行篩選、保存的高效降解菌株TZ1985。

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技發展有限公司；Z36HK超速冷凍離心機 德國HERMLE儀器公司；YGC-12D圓形氮吹儀 鄭州寶晶電子科技有限公司；BS124S分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;AP-01P真空抽濾機 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜 上海市新亞凈化器件廠生產。

1.2實驗方法

1.2.1 液相色譜條件的選擇 高效液相色譜采用反向色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5.0μm)；紫外檢測器的波長設定：290nm；流動相配比：甲醇和水(pH=3,用36.5% 醋酸調節)的比例為70∶30；流速：1.0mL/min；柱溫設定：30℃；進樣體積：10μL。

1.2.2 培養基配制的方法 PDA斜面培養基：取馬鈴薯200g,洗凈去皮后切碎,加水煮沸30min,用斜面菌種的培養紗布過濾后加入20g葡萄糖和15g瓊脂,蒸餾水1000mL,121℃高壓滅菌15min。

查氏(基礎)培養基：葡萄糖20g,FeSO40.01g,MgSO4·7H2O 0.5g,KCl 0.5g,NaNO32.0g,瓊脂20g,K2HPO41.0g,再加入蒸餾水1000mL,在121℃條件下高溫高壓滅菌20min[13-14]。

1.2.3 氟磺胺草醚的標準曲線繪制 準確稱量純度為98.0%的氟磺胺草醚除草劑0.1020g于燒杯中,加入一定量的色譜甲醇溶液使之充分溶解,轉移至250mL的容量瓶中,定容到刻度線,得到濃度為400.0mg/L的氟磺胺草醚標準儲備液。用流動相稀釋成濃度依次為：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、40、80、120mg/L氟磺胺草醚標準溶液,最后用高效液相色譜儀進行測定。

1.2.4 真菌黃曲霉最佳降解條件的確定 分別向250mL錐型瓶內裝入100mL一定pH的基礎培養基,在121℃條件下高溫滅菌1.5h。再向基礎培養基中加入一定量的氟磺胺草醚儲備液,使其成為不同濃度的反應液。然后再接種一定量的黃曲霉種子液,以不加黃曲霉種子液作為對照,每組設置3個重復,將錐型瓶置于130r/min的搖床上在一定溫度條件下避光振蕩培養一定時間。

1.2.4.1 氟磺胺草醚的濃度對降解作用影響 分別加入氟磺胺草醚儲備液,使其分別成為1、5、10、50和100mg/L濃度的反應液,進行降解實驗；考察氟磺胺草醚的濃度對降解作用影響。

1.2.4.2 培養基中的溫度對降解作用影響 分別在20、25、30和35℃條件下,進行降解實驗；考察培養基中的溫度對降解作用影響。

1.2.4.3 真菌黃曲霉的接種量對降解作用影響 分別加入1%、2%、3%、4%、5%的黃曲霉菌懸母液,進行降解實驗；考察真菌黃曲霉的接種量對降解作用影響。

1.2.4.4 培養的時間對降解作用影響 每隔0、1、3、5、7、10d取樣,用液相色譜儀進行檢測；考察培養的時間對降解作用影響。

1.2.4.5 不同pH的培養基對降解作用影響 使基礎培養基中溶液pH分別為5、7、9,以不調節pH為對照,進行降解實驗；考察不同pH的培養基對降解作用影響。

1.2.5 氟磺胺草醚除草劑降解率的測定 將反應液每隔一定的時間,在無菌操作臺上取樣5.0mL降解液,在12000r/min、4℃條件下離心15min后取上清液3.0mL,加1.0g左右的固體氯化鈉(防止乳化),搖勻、使之完全溶解后,加5.0mL(3.0+2.0)二氯甲烷萃取2次、合并有機層；加0.5g左右的無水硫酸鈉干燥,取上清液用氮氣吹干,用甲醇溶液定容至1.0mL。最后用0.22μm的有機微孔濾膜過濾,在高效液相色譜儀上進行測定氟磺胺草醚除草劑的降解率。

2 結果與討論

2.1方法的線性

根據液相色譜法的測定結果,以氟磺胺草醚除草劑的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線(如圖1)。得到線形回歸方程為：y=25.933x-0.867,相關系數為：R2=0.9997(n=3)。實驗研究結果表明,氟磺胺草醚除草劑在0.1～120mg/L濃度范圍內具有良好的線性關系。

圖1 氟磺胺草醚除草劑的標準曲線

2.2真菌黃曲霉的最佳培養條件確立

2.2.1 氟磺胺草醚的濃度對降解作用影響 在基礎培養基中黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,溫度為25℃,待反應液培養5d,測定不同濃度氟磺胺草醚的降解曲線(如圖2)表明：真菌黃曲霉菌株在基礎培養基中是以氟磺胺草醚為唯一碳源和氮源的微生物,所以對不同濃度的氟磺胺草醚的降解率存在較大差異。其中對濃度為5、10和50mg/L氟磺胺草醚的降解能力明顯高于濃度為1和100mg/L氟磺胺草醚的降解率；當氟磺胺草醚含量為10mg/L時降解率最高,為92.53%。

圖2 氟磺胺草醚的濃度對降解作用影響

2.2.2 培養基中的溫度對降解作用影響 在基礎培養基中加入濃度為10mg·L-1氟磺胺草醚,黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,待反應液培養5d時的降解曲線(如圖3)表明：不同溫度對黃曲霉的降解速率影響較大,反應液的溫度為20℃時,氟磺胺草醚的降解率為90.41%；當溫度為25℃時降解率最高,為92.5%；所以實驗選取的培養溫度為25℃。以上結果表明,溫度過低或者過高均會抑制該菌株對氟磺胺草醚的降解。因此,選擇合適的降解溫度對提高降解率具有很大意義。

圖3 培養溫度對降解作用影響

2.2.3 真菌黃曲霉的接種量對降解作用影響 微生物的數量是影響黃曲霉降解能力的重要因素之一,向氟磺胺草醚濃度為10.0mg·L-1的基礎培養基中接種不同菌量的菌懸母液,在25℃條件下振蕩培養5d時測定氟磺胺草醚的降解率,實驗結果表明(如圖4),當真菌黃曲霉的接種量為3%的菌懸母液時對氟磺胺草醚降解速率最大,為93.47%。

圖4 真菌黃曲霉的接種量對降解作用影響

2.2.4 培養的時間對降解作用影響 在基礎培養基中加入濃度為10mg·L-1氟磺胺草醚,黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,溫度為25℃,將反應液每隔0、1、3、5、7、10d測定氟磺胺草醚的降解率,實驗結果表明(如圖5)：培養5d時降解率為95.36%,培養10d時的降解率為98.64%。因此,黃曲霉菌株在培養到5d即可將氟磺胺草醚基本降解完全。

圖5 培養的時間對降解作用影響

2.2.5 不同pH的培養基對降解作用影響 基礎培養基中反應液的pH是影響氟磺胺草醚降解的一個非常重要因素。使基礎培養基中溫度為25℃,濃度為10mg·L-1氟磺胺草醚,黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,將反應液每隔0、1、3、5d測定氟磺胺草醚除草劑的降解曲線(如圖6)表明：在對照培養基中氟磺胺草醚降解率最高,在pH為5、7和9的反應液中降解速率基本相同,以上結果表明,對照培養基中黃曲霉對氟磺胺草醚的降解速率最快。因此,選擇合適的pH對提高降解率有很大意義。

圖6 不同pH的培養基對降解作用影響

3 結論

實驗確立了真菌黃曲霉在基礎培養基中對氟磺胺草醚除草劑最適宜的降解條件：在不調節反應液pH條件下,氟磺胺草醚濃度為10mg/L、溫度為25℃、黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,培養時間為5d。實驗結果表明,該菌株適應一般的環境條件下,即可以對氟磺胺草醚除草劑起到較好的降解作用,為以后人們研究其它菌株對該類除草劑的降解提供了理論依據。

[1]Jiyeon H,Cady R E,James R W. Biodegradation of coumaphos,chlorferon,and diethylthiophosphate using bacteria immobilized in Caalginate gel beads[J]. Bioresource Technology,2009,100(3):1138-1142.

[2]戰徊旭,任洪雷,蔣凌雪,等.氟磺胺草醚降解菌的分離鑒定及生長特性研究[J].作物雜志,2011,(2):40-44.

[3]丁偉,楊隆華,程茁,等.氟磺胺草醚對大豆根瘤固氮酶活性及光合速率的影響[J].作物雜志,2011,(4):81-84.

[4]Yang L M,Yang Q,Liu P G,etal. Expression of the HSP24 gene from Trichoderma harzianum inSaccharomycescerevisiae[J].Journal of Thermal Biology,2008,33(1):1-6.

[5]鄒月利,陶波.磺酰脲類除草劑的降解機制及代謝產物的研究進展[J].農藥科學與管理,2011,32(10):24-31.

[6]Huang X,He J,Sun J Q,etal. Isolation and characterization of a metsulfuron-methyl degrading bacterium Methylopila sp. S113[J]. International Biodeterioration & Biodegradafion,2007,60(3):152-158.

[7]鄒月利,陶波.氯嘧磺隆高效降解菌株黑曲霉(TR-H)最佳降解條件的研究[J].植物保護,2012,38(6):86-89.

[8]Choudhury P P,Dureja P. Simultaneous determination of chlorimuron-ethyl and its major metabolites in soil and water by reversed phase liquid chromatography[J].Biomedical Chromatography,1998,12(2):94-96.

[9]Bo Liang,Peng Lu,Hui hui Li,etal. Biodegradation of fomesafen by strainLysinibacillussp. ZB-1 isolated from soil[J]. Chemosphere,2009,77:1614-1619.

[10]步海燕.新型除草劑甲硫嘧磺隆在液相中的降解與代謝研究[D].武漢：華中師范大學,2008.

[11]Li X H,Jiang J D,Gu L F,etal. Diversity of chlorpyrifos degrading bacteria isolated from chlorpyrifos contaminated samples[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2008,62(4):331-335.

[12]李陽,孫慶元,宗娟,等.一株降解氟磺胺草醚的黑曲霉菌特性[J].農藥,2009,48(12):878-880.

[13]Yu Y L,Wang X,Luo Y M,etal. Fungal degradation of metsulfuron-methyl in pure cultures and soil[J]. Chemosphere,2005,60(4):460-466.

[14]丁偉,楊薇,白赫,等.長殘留除草劑氯嘧磺隆降解菌的篩選、鑒定和降解特性[J].作物雜志,2007,(4):88-90.

[15]鄒月利,陶波.除草劑氯嘧磺隆在培養基中的提取和檢測方法研究[J].作物雜志,2012,(6):48-51.

Research of optimum degradation conditions of fomesafen byAspergillusflavus

CUIWen-juan1,ZOUYue-li1,*,TAOBo2,*,SUNNing1,ZHAODi1,ZHUMei-hua1,ZHANGRu-ru1

(1. College of Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2. College of Agricluture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this paper,high performance liquid chromatography(HPLC)was used to determine the degradation rate of fomesafen under different conditions. The optimum degradation condition of fomesafen was obtained byAspergillusflavus(TZ1985). The optimum conditions for the fomesafen degradation without adjusting pH condition were found as follows:concentration of fomesafen 10mg/L,inoculum volume of bacteria suspension 3%,temperature 25℃,shaking for 5d and the degradation rate was 92.5%.

fomesafen;Aspergillusflavus;liquid chromatography;degradation conditions

2013-06-25 *通訊聯系人

崔文娟(1992-),女,本科,研究方向:除草劑降解及殘留檢測。

東北農業大學大學生創新創業訓練計劃資助項目(2013063)；國家自然科學基金項目(30971834)。

TS201.3

：A

：1002-0306(2014)01-0178-04