超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究

,,*, ,

(1.西南大學資源環境學院,重慶 400715； 2.西南大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400715； 3.西南大學藥學院,重慶 400715)

超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究

劉亞敏1,2,劉玉民1,2,*,李瓊3,尚艷雙1,2

(1.西南大學資源環境學院,重慶 400715； 2.西南大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400715； 3.西南大學藥學院,重慶 400715)

以山銀花為材料,采用高效液相法檢測綠原酸,建立了超聲波輔助提取綠原酸的工藝組合。通過單因素實驗研究了提取時間、固液比、超聲波功率、超聲波頻率四個主要因素對綠原酸提取的影響。在單因素實驗的基礎上采用L9(34)正交實驗優選山銀花綠原酸提取工藝條件。結果表明：室溫下,溶劑為體積分數為50%的乙醇,超聲波輔助山銀花綠原酸的最佳提取工藝組合為超聲波提取50min、固液比1∶50、超聲波功率300W、超聲波頻率59kHz,在此條件下綠原酸提取率達到88.7624mg/g。驗證實驗表明該工藝組合提取率高,穩定性良好。山銀花綠原酸提取物有一定的還原能力和較好的清除DPPH自由基的能力,是很好的功能性食品資源。

山銀花,綠原酸,超聲波輔助提取,工藝優化

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、華南忍冬(LoniceraconfuseDC.)或黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或初開的花。味甘、寒,歸肺、心、胃經,具有清熱解毒,疏散風熱的功效。用于治療癰腫疔瘡,喉痹,丹毒,熱毒血痢,風熱感冒及溫熱發病等[1]。現在研究發現山銀花具有較強的抗動脈粥樣硬化作用[2]。山銀花提取物具有顯著的抗病毒作用,體外對PRV和NDV具有明顯的阻斷、抑制和中和作用,其中山銀花對PRV體外的抑制作用強于金銀花[3-4]。山銀花還被廣泛應用于食品、飲料、保健品、化妝品和獸藥等方面[5],市場需求量在逐年增加。綠原酸為山銀花的主要活性成分之一,現代藥理學研究表明,綠原酸具有廣泛的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、提高白細胞數量、降血脂、增強免疫調節、保肝利膽作用[6-12]。山銀花中灰氈毛忍冬綠原酸含量較高,很適宜作為綠原酸的提取原料[13]。超聲波提取技術是利用超聲波輻射壓強產生的機械振動、空化效應及擾動效應等,增加溶劑穿透力,從而加速目標成分進入溶劑,促進提取的進行。近年來被廣泛的應用于藥用植物活性成分的提取,具有節約能源、提高效率并且避免高溫對有效成分的影響等優點[14]。目前綠原酸的提取多采用水提醇沉法、醇提鉛沉法、石灰乳沉淀法等,這些傳統方法提取效率較低且提取物中雜質較多,醇提鉛沉還帶來重金屬鉛污染[14]。本實驗利用超聲波可有效提高提取效率的特點,對超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝組合進行了研究,采用高效液相檢測綠原酸[15],以綠原酸為考察指標,運用正交設計優選山銀花綠原酸的最佳提取工藝組合,對目前幾個主產地的山銀花品種的綠原酸含量進行了檢測,并對山銀花的抗氧化能力進行了研究,以期對山銀花的深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

山銀花 采自重慶秀山山銀花生產基地,經西南大學林學教研室鑒定為忍冬科灰氈毛屬植物品種為渝蕾一號,新鮮花蕾經殺青烘干后粉碎過20目篩備用；甲醇、無水乙醇 為分析純；乙腈、磷酸 為色譜純；綠原酸標準品 色譜純≥98%中國藥品生物制品檢定所；蒸餾水 實驗室自制。

D-7000高效液相色譜儀 日本日立公司；數控超聲波清洗機SG8200HBT 上海冠特超聲儀器有限公司；電子天平FA2004B 上海越平科學儀器有限公司；SHB-3循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；RE-52旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 綠原酸的測定方法 色譜條件：以十八烷基鍵合硅膠為填充劑,色譜柱型號為Allsphere ODS(250mm×4.6mm,2.5μm)；流動相為乙腈(A)和0.5%磷酸溶液(B)梯度洗脫,A：0～11min,10%～20%,11～21min,20%～25%,21～30min,25%～30%。流速1.0mL/min,進樣量10μL,檢測波長355nm,柱溫30℃。

1.2.2 線性關系的考察 精確稱取綠原酸對照品5g,70%甲醇溶解并定容于100mL容量瓶,搖勻,配制成濃度為50mg/mL綠原酸標準溶液。分別精確吸取綠原酸對照品溶液0、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0mL,分別置于50mL容量瓶中,以70%甲醇定容,按1.2.1色譜條件進行測定。

1.2.3 樣品的制備 精確稱取樣品粉末于設定條件下進行提取(5個重復),超聲波提取三次,濾液合并,揮干溶劑后用70%的甲醇定容于100mL容量瓶中,搖勻,從提取溶液中取1mL用70%的甲醇定容于50mL容量,于1.2.1色譜條件下進行測定,采用2.1回歸方程進行計算。

式中：Y為山銀花綠原酸提取率(mg/g)；C為依據回歸方程計算的提取液中綠原酸的質量濃度(mg/mL)；V1為樣品提取液的總體積(100mL)；V2為測定樣品時定容體積(50mL)；V3為測定樣品時取樣體積(1mL)。

1.2.4 實驗條件 提取時間篩選：于固液比1∶30,超聲波功率200W,超聲波頻率40kHz條件下,設置提取時間為5、10、20、30、40、50、60min,研究提取時間對綠原酸提取率的影響。

固液比篩選：于超聲波功率200W,超聲波頻率40kHz,超聲波提取30min條件下,設置固液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,研究固液比對綠原酸提取率的影響。

超聲波功率篩選：于固液比1∶30,超聲波頻率40kHz,超聲波提取30min條件下,設置超聲波功率為150、200、250、300、350、400W,研究超聲波功率對綠原酸提取率的影響。

超聲波頻率篩選：于固液比1∶30,超聲波功率200W,超聲波提取30min條件下,設置超聲波頻率0、40、50、59kHz,研究超聲波頻率對山銀花綠原酸提率的影響。

取來自不同產地的樣品2g(5個重復),室溫下,于正交優選條件下進行提取,采用高效液相色譜法檢測綠原酸含量。

1.2.5 正交實驗設計 根據單因素實驗的結果,確定提取時間(A)、固液比(B)、超聲波功率(C)、超聲波頻率(D)為實驗因素,進行正交實驗設計(提取溶劑為50%乙醇,于室溫條件下),選用L9(34)正交設計表進行實驗(表1),優化山銀花綠原酸提取工藝。

表1 綠原酸正交實驗水平表Table 1 Orthogonal experiment level tableof the chlorogenic acid

1.2.6 DPPH自由基清除率測定[16]精確取DPPH粉末0.001g,用無水乙醇溶解定容于100mL容量瓶中,配制成濃度0.01mg/mL溶液備用。將山銀花綠原酸提取液配稀釋成不同濃度梯度備用。各取不同濃度的稀釋液2mL于試管中,加入2mL配制好的DPPH溶液搖勻,30min后,于517nm處測定其吸光度(A1)；以2mL無水乙醇替代2mL DPPH的測吸光度(A2)；以2mL無水乙醇替代2mL待測溶液吸光度(A0)。按照以下公式計算DPPH自由基清除率。

1.2.7 Fe3+還原力測定[16-17]取2.5mL不同濃度梯度的金銀花綠原酸提取液,加入2.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH=6.6)和2.5mL 1%的鐵氯化鉀溶液,50℃水浴20min后快速冷卻,加入10%三氯乙酸2.5mL,取以上混合液5mL,加蒸餾水4mL及0.1%三氯化鐵溶液1mL,混合10min后于700nm處測定其吸光度。

1.3數據分析

用Microsoft Excel和DPS軟件進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1綠原酸檢測結果

采用1.2.1檢測方法對山銀花提取液進行檢測。根據1.2.2方法,以峰面積積分值(y)為縱坐標,對照品濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線,得回歸方程：y=0.199x+0.0014,r=0.9997。本結果為計算綠原酸提取率的依據。

山銀花提取液中含有大量綠原酸如圖1所示,于保留時間20min處還有一主要成分峰。提取液中除2種主要成分外還含有10余種化合物。

圖1 高效液相色譜

2.2山銀花綠原酸提取的單因素實驗

2.2.1 提取時間對綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察提取時間對提取效果的影響,結果見圖2：隨提取時間的延長,綠原酸提取率迅速增大,當超聲波提取超過30min時,綠原酸的提取率增加速度變緩。考慮到綠原酸的有效溶出同時避免長時間局部高溫對提取物化學結構的破壞并盡可能節約能源,正交實驗設計中提取時間設置為30～50min。

圖2 超聲波提取時間對綠原酸提取率的影響

2.2.2 固液比對綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察固液比對提取效果的影響,結果見圖3：隨溶劑量的增加,綠原酸提取率逐漸增大,固液比1∶30后綠原酸提取率趨于穩定。原因可能是溶劑量增加后,濃度梯度變大,有利于綠原酸的溶出,從而使其溶出速度和提取率變大。當原料里的綠原酸充分溶出后,再增大溶劑量,綠原酸的提取率也不再增加。考慮到綠原酸有效的溶出,且不浪費溶劑,故正交實驗設計中固液比的設置為1∶30～1∶50。

圖3 固液比對綠原酸提取率的影響

2.2.3 超聲波功率對綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察超聲波功率對提取效果的影響,結果見圖4：隨超聲波功率的增加,山銀花綠原酸提取率逐漸增大,當超聲波功率達到300W時,山銀花綠原酸提取率達到最大值,超聲波功率繼續增大,山銀花綠原酸提取率反而降低。這可能與超聲波的空化效應有關,超聲波提取中可以產生很多的微泡,這些小空洞迅速膨大閉合,引起微粒間的劇烈撞擊,使液體局部溫度驟然增高,高溫使不穩定的綠原酸的鄰二酚羥基結構被氧化分解從而使提取率有所下降[18-19]。為保證綠原酸的充分提取并避免化合物的分解以及節約能源,正交實驗設計中超聲波功率的設置為：250～350W。

2.2.4 超聲波頻率對山銀花綠原酸提取的影響 其它條件一定時,考察超聲波頻率對提取效果的影響,結果見圖5：室溫下相同時間內使用超聲波方法的提取效率遠高于不使用者,隨超聲波頻率增加，山銀花綠原酸的提取率逐漸增加。這可能是由于超聲波所具有的機械效應和溫熱效應,使細胞振蕩、摩擦,并刺激細胞半透膜的彌散過程,超聲波的頻率越高分子震動的頻率越高,具有的能量越大,細胞內物質向外滲出的速度越快。同時由于超聲波具有的空化效應,產生很多的微泡,這些小空洞迅速的膨脹閉合,產生很好的攪拌作用,并能打碎細胞壁,加速綠原酸的向外溶出[18,20]。正交實驗設計中超聲波頻率的設置為40～59kHz。

圖4 超聲波功率對綠原酸提取的影響

圖5 超聲波頻率對綠原酸提取率的影響

2.3正交實驗優化山銀花綠原酸提取工藝

按照表1的因素水平,采用L9(34)正交實驗方法,優選山銀花綠原酸提取工藝(見表2),并對實驗結果進行了方差分析(見表3)。結果表明：提取時間(A)、固液比(B)、超聲波功率(C)、超聲波頻率(D)均對綠原酸的提取有極顯著的影響；各因素的優先次序為D>B>C>A,即超聲波頻率>固液比>超聲波功率>提取時間。通過極差分析及單因素多重比較確定最佳的工藝組合為A3B3C2D3。

從表2中可知,9組實驗,提取效率最高的為實驗3(A1B3C3D3),采用正交優選最佳工藝組合A3B3C2D3和A1B3C3D3兩種提取工藝組合進行提取,綠原酸提取率分別為：88.7624、83.2274mg/g。結果表明,通過極差分析得到的山銀花綠原酸的最佳提取工藝組合A3B3C2D3優于正交設計中的A1B3C3D3。室溫下,溶劑為50%的乙醇(體積分數),超聲波輔助山銀花綠原酸提取的最佳工藝條件組合為：提取時間：50min,固液比：1∶50,超聲波功率：300W,超聲波頻率：59kHz。

2.4正交優化組合穩定性實驗

為驗證優選工藝的可靠性及穩定性,依上述優選所得工藝條件進行5次平行實驗,經檢測綠原酸提取率平均為88.7624mg/g,相對標準偏差RSD為1.28%。結果：綠原酸得率較高且穩定性良好,適宜于生產應用。

2.5不同產地山銀花的綠原酸含量檢測

采用正交優選最佳工藝組合對不同產地山銀花綠原酸進行提取檢測,結果表明(見表4)：重慶秀山的灰氈毛忍冬和湖南隆回的灰氈毛忍冬系列品種(金翠蕾、湘銀翠蕾、白云)綠原酸含量明顯高于產自廣西上思的華南忍冬、貴州安龍的黃褐毛忍冬和廣西忻城的紅腺忍冬。

表2 正交實驗結果

表3 綠原酸正交實驗方差分析

注：F0.01(2,18)=6.01。

2.6山銀花提取液對DPPH自由基清除作用

如圖6中所示,抗壞血酸、綠原酸、山銀花提取液均對DPPH自由基有很好的清除效果。山銀花提取液和綠原酸標品在低濃度時對DPPH自由基的清除能力遠高于抗壞血酸,呈線性增長。山銀花提取液和綠原酸分別于濃度10、15μg/mL清除率達到90.22%和93.25%。在低濃度范圍時山銀花提取液對DPPH自由基的清除率高于綠原酸,這可能與金銀花提取液中所含黃酮類、酚類、皂苷類等化合物有關(如圖1所示),但濃度大于15μg/mL后,清除能力相當,表明在山銀花提取液中綠原酸是主要的抗氧化成分。

表4 不同產地山銀花綠原酸含量測定

圖6 山銀花提取液、抗壞血酸和綠原酸 對DPPH自由基的清除作用

2.7山銀花提取液對Fe3+還原作用

植物中含有多種抗氧化物質,可使Fe3+還原成Fe2+,通過比色法測定,在700nm處吸光度值越大,其還原能力越強。如圖7所示抗壞血酸具有較強的還原性,隨濃度增大抗壞血酸對Fe3+的還原能力逐漸增大。山銀花提取液和綠原酸在低濃度時,還原能力較差兩者相差不大。山銀花提取液濃度大于40μg/mL后,隨濃度的增大還原能力有大幅的增加。

圖7 山銀花提取液、綠原酸和抗壞血酸還原能力測定

3 結論與討論

本研究對超聲波輔助山銀花綠原酸的提取工藝組合進行了實驗,通過數據分析可知：提取時間、固液比、超聲波功率和超聲波頻率均對山銀花綠原酸提取有極顯著的影響,影響的大小依次為超聲波頻率>固液比>超聲波功率>提取時間；通過極差分析及單因素多重比較確定最佳的工藝組合為A3B3C2D3,即提取時間50min,固液比1∶50,超聲波功率300W,超聲波頻率59kHz。在此條件下綠原酸提取率達到88.7624mg/g。

山銀花綠原酸提取物具有一定的還原能力,且隨濃度增加還原能力有較大的增加。山銀花綠原酸提取液在低濃度時即表現較好的清除DPPH自由基的能力,當濃度為10μg/mL時其清除率可達到90.22%。低濃度時的清除能力遠高于抗壞血酸。山銀花綠原酸提取液具有一定的還原能力和較好的清除DPPH自由基的能力,可作為抗氧化的功能性食品進行進一步開發利用。

植物有效成分的提取中,原料的粉碎度對提取有一定的影響,植物的次生有效成分,存在于細胞內,通過對原料的處理,使其顆粒變小,增加與溶劑的接觸面積,便于有效成分的提取[20-21]。本實驗中實驗原料為植物的花蕾,前期實驗發現原料20目即可很好的滿足實驗的需要,這可能與超聲波的強大穿透能力和機械效應有關。雖然植物有效成分提取中,溫度也為非常重要的一個因子,但由于超聲波的空化效應和熱效應的存在,無法明確設定溫度對山銀花綠原酸提取率的影響,故本次未將其設定為參考因子。

超聲波提取技術工藝運行成本低,操作簡單易行,并且提取溫度低,可以保護有效成分。超聲波提取技術的運用可以大大提高山銀花綠原酸提取效率并且節約能源,具有推廣價值。山銀花綠原酸含量高,非常適合作為綠原酸工業化生產的原料,不同產地不同品種的山銀花綠原酸含量有一定的差異,在引種中應選擇適應當地條件的優良品種進行發展。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:28.

[2]李榮,周玉生,匡雙玉,等.山銀花提取物抗動脈粥樣硬化成分研究[J].中國現代應用藥學,2011,28(2):92-95.

[3]王林青,張紅英,崔保安,等.金銀花、山銀花綠原酸類提取物體外抗NDV作用研究[J].中國農學通報,2011,27(19):277-282.

[4]王林青,崔保安,張紅英.金銀花、山銀花黃酮類提取物體外抗偽狂犬病病毒作用研究[J].中國畜牧獸醫,2011,38(3):183-188.

[5]王志萍,鄧家剛,王勤,等.山銀花研究的最新進展[J].廣西中醫學院學報,2008,11(4):59-61.

[6]Ronsted N,Strandgaard H,Jensen S R,etal. Chlorogenic acid from three species of Hydrostachys[J].Biochemical Systematicsand Ecology,2002,30(11):1105-1108.

[7]Award M A,Jager A,Westing L M. Flavonoid and chlorogenic acid levels in apple fruit:Characterisation of variation[J].Scientia Horticulturase,2000,83(3-4):249-263.

[8]He C X,Cui H,Zhao G W. The determination of chlorogenic acid in cigarettes by inhibited chemiluminescence analysis[J]. Analytica Chimica Acta,1997,351:241-246.

[9]胡仲秋,洪小迪,岳田利.光皮木瓜綠原酸的提取及抗菌活性測定[J].食品科學,2010,31(24):8-13.

[10]Viviane M,Adriana F. Chlorogenic acids and related compounds in medicinal plants and infusions[J]. Food Chemistry,2009,113:1370-1376.

[11]Farah A,Donangelo C M. Phenolic compounds in coffee[J].Brazilian Journal of Plant Physiology,2006,18:23-36.

[12]Wang G F,Shi L P,Ren Y D,etal. Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid,quinic acid and caffeic acidinvivoand invitro[J]. Antiviral Research,2009,83:186-190.

[13]孫健,吳國娟.綠原酸的研究進展[J].中獸醫學雜志,2009,1:47-50.

[14]高錦明,張鞍靈,張康健,等.綠原酸分布、提取與生物活性研究綜述[J].西北林學院學報,1999,14(2):73-82.

[15]張元元.李進,陳濤,等.高效液相色譜法同時測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量[J].天津中醫藥大學學報,2011,30(2):107-109.

[16]康如龍,劉倩,蘇小建,等.冬瓜皮提取物抗氧化活性的研究[J].食品科技,2013,38(3):218-222.

[17]王小波,何曉燕,王梅，等.火龍果皮總黃酮提取與體外抗氧化作用研究[J].食品科技,2011,32(11):156-163.

[18]朱兆友,汝紹剛,朱慶書.超聲輔助提取藿香揮發油的研究[J].化學與生物工程,2010,27(6):85-87.

[19]肖卓炳,郭瑞軻,郭滿滿,等.金銀花中綠原酸超聲微波雙輔助提取工藝優化[J].食品科學,2012,33(22):111-114.

[20]劉玉萍.紫蘇色素的超聲波輔助提取工藝研究[J].食品工業,2012,33(7):19-21.

[21]周鳴謙,王仁財.超臨界CO2萃取柑橘落果中的辛弗林[J].中國食品學報,2013,13(3):78-83.

Optimization of ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of chlorogenic acid fromLoniceramacranthoidesHand.-Mazz.

LIUYa-min1,2,LIUYu-min1,2,*,LIQiong3,SHANGYan-shuang1,2

(1.College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715,China； 2. College of Life Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China; 3. College of Pharmaceutical sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The object of this research was to optimize ultrasonic-assisted extraction process of chlorogenic acid fromLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. The chlorogenic acid was tested by HPLC. To maximize the extraction of chlorogenic acid,main technological parameters like ultrasonic extraction time,ethanol concentration,solid/liquid ratio and temperature,were investigated by single factor method coupled with L9(34)orthogonal array design. Results showed that the optimal conditions of extracting chlorogenic acid fromLoniceramacranthoideswas 50% ethanol,ultrasonic power 300W,ultrasonic frequency 59kHz,extracting 50min,with a solid/liquid ratio of 1∶50.Under above conditions,the extraction yield of chlorogenic acid reached 88.7624 mg/g. It was proved that this extracting technology was reasonable and feasible. The results demonstrated that extract fromLoniceramacranthoideshad certain reduction capacity and potent DPPH radical scavenging capacity and could be used as antioxidants and in functional foods.

LoniceramacranthoidesHande-Mazz.;chlorogenic acid;ultrasonic-assisted extraction;optimization

2013-06-17 *通訊聯系人

劉亞敏(1976-)，女，碩士，副教授，主要從事藥用植物資源利用方向的研究。

國家自然科學基金面上項目(31170546)；中央高校基本業務費專項(XDJK2010C042)；國家林業局公益性行業科研專項(201004043)；西南大學生態學重點學科“211工程”建設項目。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0186-06