紅曲霉固態發酵產木聚糖酶培養基的響應面優化

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(四川農業大學食品學院，四川雅安 625014)

紅曲霉固態發酵產木聚糖酶培養基的響應面優化

劉波1，鄔應龍1,*，張霞2，黃雅麗2

(四川農業大學食品學院，四川雅安 625014)

研究了碳源、氮源、無機鹽對紅曲霉M2固態發酵產木聚糖酶酶活的影響。在單因素實驗的基礎上，采用響應面實驗設計對紅曲霉固態發酵產木聚糖酶的培養基進行了優化，并建立了玉米粉、牛肉膏、K2HPO4變化的二次回歸方程，探討了各因子對木聚糖酶酶活的影響。最終確定適宜的培養基條件為：玉米粉添加量為1.90g、牛肉膏添加量為0.55g、K2HPO4添加量為0.10g；在該條件下可得到紅曲霉M2產木聚糖酶的最大酶活，預測值為1550.62U/g，對實驗結果進行驗證，得到木聚糖酶酶活為1545.38U/g。

紅曲霉，固態發酵，木聚糖酶，Box-Behnken設計

木聚糖是半纖維素的主要成分，同時也是自然界中僅次于纖維素的第二大可再生資源[1]。木聚糖酶是指專一降解木聚糖為寡木聚糖、低聚木糖、木二糖和木糖的一組酶的總稱[2-4]。木聚糖酶在造紙、食品、飼料、加工等方面具有潛在的應用價值[5-9]。近年來隨著生物科學的迅速發展，使得木聚糖酶在生物技術、合成調節和分子生物學方面的研究取得一定的進展。主要包括基因工程[10]，蛋白質工程，固定化細胞技術[11]，離子束誘變育種技術[12]。木聚糖酶的生產菌有很多，包括細菌[13-15]、霉菌[16-17]和酵母菌等，但是利用紅曲霉進行固態發酵產木聚糖酶的研究幾乎未見報道。因此，本研究在對木聚糖酶產生菌的最佳碳源、氮源和無機鹽的種類和數量需要進行系統研究的基礎上，應用響應面法[18-22](response surface methodology，RSM)對其固態發酵培養基組成進行篩選和優化，旨在提高該菌株的產酶量。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紅曲霉M2 四川農業大學功能性實驗室保藏；麩皮 雅安市雨城區農貿市場購買；NaNO3、MgSO4、K2HPO4、葡萄糖等 均為國產分析純；PDA培養基(斜面) 300.0g/L土豆，20.0g/L葡糖糖，20.0g/L瓊脂；種子培養基 300.0g/L土豆，20.0g/L葡糖糖；固態發酵基礎培養基 麩皮10.0g，蒸餾水12.0mL；BT-124S型電子天平 北京賽多利儀器系統有限公司；DHP-420電熱恒溫培養箱 重慶四達實驗儀器有限公司順達儀器廠；HHS-9S型恒溫水浴鍋 上海光地儀器設備有限公司；JOUANBR4i型冷凍離心機 Thermo公司；UV-2102型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 取培養好的斜面，用無菌生理鹽水洗脫孢子后轉移至裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，充分搖動使孢子散開，用帶脫脂棉的無菌漏斗過濾除去菌絲得到孢子懸液，將孢子濃度調整到106個/mL。

1.2.2 固態發酵培養 將1mL孢子懸液接種到固態發酵基礎培養基中，在32℃下，恒溫培養6d測定其酶活。

1.2.3 粗酶液的制備 取培養后的固態發酵培養物，先稱重，然后加蒸餾水100mL，在40℃水浴中浸提1h，四層紗布過濾，3000 r/min離心15min。

1.2.4 指標測定方法(DNS 法[23]測定酶活性) 酶活性單位定義為：在該實驗條件下，每分鐘水解木聚糖形成1μmol木糖(還原糖)所需酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.5 培養基成分的篩選

1.2.5.1 碳源對產酶的影響 在固態發酵基礎培養基中，分別添加1%(w/w)的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和乳糖，于恒溫培養箱中32℃培養6d后測定酶活。根據酶活的大小確定最佳的碳源種類。

1.2.5.2 氮源對產酶的影響 在固態發酵基礎培養基中，分別添加1%(w/w)的蛋白胨、牛肉膏、尿素、NaNO3和(NH4)2SO4，于恒溫培養箱中32℃培養6d后測定酶活。根據酶活的大小確定最佳的氮源種類。

1.2.5.3 無機鹽對產酶的影響 在固態發酵基礎培養基中，分別添加0.1%(w/w)的K2HPO4、KH2PO4、MgSO4∶7H2O、MnCl2∶4H2O、CuSO4∶5H2O和CaCl2，于恒溫培養箱中32℃培養6d后測定酶活。根據酶活的大小確定最佳的無機鹽種類。

1.2.6 培養基各成分添加量的單因素實驗

1.2.6.1 碳源添加量對產酶的影響 根據碳源的篩選結果，選擇酶活最高的作為最適碳源。在固態發酵基礎培養基中，分別添加1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%。然后于恒溫培養箱中32℃培養6d后測定酶活。根據酶活的大小確定最佳的碳源添加量。

1.2.6.2 氮源添加量對產酶的影響 根據氮源的篩選結果，選擇酶活最高的作為最適氮源。在固態發酵基礎培養基中，分別添加1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%。然后于恒溫培養箱中32℃培養6d后測定酶活。根據酶活的大小確定最佳的氮源添加量。

1.2.6.3 無機鹽添加量對產酶的影響 根據無機鹽的篩選結果，選擇酶活最高的作為最適無機鹽。在固態發酵基礎培養基中，分別添加0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%。然后于恒溫培養箱中32℃培養6d后測定酶活。根據酶活的大小確定最佳的無機鹽添加量。

1.2.7 響應面優化設計 根據單因素的試驗結果，選用玉米粉、牛肉膏、K2HPO4為考察因素，采用Box-Behnken中心組合實驗設計，設計三因素三水平的響應面分析(RSA)實驗，實驗因子和編碼水平如表1。

表1 實驗因素水平及編碼水平

1.2.8 數據處理 每個實驗處理進行3次重復，取其平均值進行相關分析。利用Design Expert v7.0.0(Stat-Ease,Inc. Minneapolis,MN,USA)軟件進行統計分析。

2 結果與討論

2.1培養基成分的篩選

2.1.1 碳源的篩選 碳源作為真菌培養基的基本成分之一，能夠為真菌的生長代謝提供能量。同時它也是菌體細胞組成的原料，也是菌體生長發育必需的能源物質。某些碳源是酶的誘導物，選擇適宜的碳源有利于定向促進某些酶的合成。不同碳源對木聚糖酶酶活的影響如圖1所示。紅曲霉可以利用不同的碳源，但碳源類型對木聚糖酶酶活的高低影響較小。其中以玉米粉為碳源時，木聚糖酶酶活要高于其他的幾種碳源。因此，選用玉米粉作為紅曲霉固態發酵培養基的最佳碳源。

圖1 碳源對木聚糖酶酶活的影響

2.1.2 氮源的篩選 氮的主要功能是提供細胞原生質和其他結構物質中的氮素,是微生物細胞需要量僅次于碳的元素。它是真菌培養基的基本成分之一，用于合成蛋白質、核酸等含氮類代謝物。不同氮源對木聚糖酶酶活的影響如圖2所示。紅曲霉能很好的利用有機氮源蛋白胨和無機氮源牛肉膏。兩種有機氮源中，牛肉膏的效果明顯好于蛋白胨。在三種無機氮源中，以NaNO3的效果最好。總體而言，有機氮源的效果好于無機氮源。故選擇以牛肉膏作為紅曲霉固態發酵培養基的最佳氮源。

圖2 氮源對木聚糖酶酶活的影響

2.1.3 無機鹽的篩選 除了上述的碳源和氮源外，微生物通常還需要一定量的無機鹽來調節其生長代謝，比如磷是核酸和蛋白質的重要組成成分，能夠影響微生物的生長；而鎂作為許多重要酶的激活劑則能夠影響基質氧化和蛋白質合成。不同無機鹽對木聚糖酶酶活的影響如圖3所示。添加K2HPO4的木聚糖酶酶活最高，說明K2HPO4對紅曲霉產木聚糖酶優于其他幾種無機鹽。因此，選擇在固體培養基中添加K2HPO4。

圖3 無機鹽對木聚糖酶酶活的影響

2.2培養基各成分添加量的單因素實驗

2.2.1 玉米粉添加量對酶活的影響 根據碳源的篩選結果，紅曲霉固態發酵選用玉米粉作為最佳碳源。如圖4所示，考察了玉米粉添加量對木聚糖酶酶活的影響。由圖4可以看出，隨著玉米粉添加量的增加，木聚糖酶酶活逐漸升高；當玉米粉的添加量達到10%時，酶活達到最大，可達475.07U/g；而當玉米粉添加量繼續增加時，木聚糖酶酶活反而下降，這表明過大的添加量并不利于酶活的增大。這可能是由于在培養空間一定時，玉米粉的添加量越多，通氣量降低，導致生物量的積累下降從而使紅曲霉的生長及產酶受到了一定的抑制。故在本實驗的考察范圍內玉米粉的最佳添加量為10%。

圖4 玉米粉的不同添加量對木聚糖酶酶活的影響

2.2.2 牛肉膏添加量對酶活的影響 如圖5所示，添加量在1%～2%的范圍內，木聚糖酶酶活隨著牛肉膏的增加而增大，但當牛肉膏的添加量超過2%時，木聚糖酶酶活隨著牛肉膏的增加而減小。這表明過多的添加量并不利于酶活的升高，只有適宜的添加范圍內才有利于紅曲霉產木聚糖酶。原因可能在于牛肉膏添加量的增加使發酵基質過于稠密，黏度增大，影響發酵過程中微生物所需的氧氣。故在本實驗的考察范圍內牛肉膏添加量應選擇2%,此時酶活可達243.72U/g。

圖5 牛肉膏的不同添加量對木聚糖酶酶活的影響

2.2.3 K2HPO4添加量對酶活的影響 如圖6所示，添加量在0.1%～0.4%范圍內，木聚糖酶的酶活隨著K2HPO4添加量的增加而增大，原因可能在于K2HPO4作為酶激活劑能夠激活紅曲霉產木聚糖酶的活性。但當K2HPO4濃度超過0.4%時，木聚糖酶酶活隨著K2HPO4的增加而減小。這表明過大的添加量并不利于紅曲霉產木聚糖酶。只有適宜的添加量條件下才有利于紅曲霉產木聚糖酶。故在本實驗的考察范圍內K2HPO4的最佳添加量為0.4%，此時酶活可達588.26U/g。

圖6 K2HPO4的不同添加量對木聚糖酶酶活的影響

2.3響應面實驗設計優化結果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design Expert v7.0.0(Stat-Ease,Inc. Minneapolis,MN,USA)軟件進行統計分析。根據表2的試驗結果,對表中數據進行多元回歸擬合，得到紅曲霉固態發酵產木聚糖酶酶活(Y)對玉米粉(X1)、(NH4)2SO4(X2)、K2HPO4(X3)的多項回歸方程為：Y=1462.71+102.52X1+53.49X2+209.57X3-6.89X1X2-34.47X1X3-43.22X2X3-108.24X12-117.00X22-149.46X32。對實驗結果進行方差分析，結果如表3所示。

表3 木聚糖酶酶活多項式回歸模型方差分析

2.3.2 響應面優化及分析 由回歸方程所作的響應面立體分析圖如圖7～圖9所示，它們分別反映了玉米粉(X1)、牛肉膏(X2)、K2HPO4(X3)這三個因素的兩兩交互作用對響應值的影響。玉米粉和牛肉膏對木聚糖酶的影響如圖7所示，當玉米粉的添加量一定時，木聚糖酶的酶活隨著牛肉膏添加量的增加而增大，但當牛肉膏的添加量大于0.55g時，木聚糖酶酶活呈下降趨勢。當牛肉膏的添加量一定時，隨著玉米粉添加量的增加，木聚糖酶的酶活隨著玉米粉添加量的增加而增大，但當玉米粉的添加量繼續增大時，木聚糖酶酶活逐漸降低。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。如圖8所示，X3因素(K2HPO4)與X1因素(玉米粉)交互作用顯著。等高線與X3因素(K2HPO4)的交點多于與X1因素(玉米粉)的交點，因此玉米粉、K2HPO4的交互作用中，K2HPO4對木聚糖酶酶活的影響較大，為主效應因子。牛肉膏和K2HPO4對木聚糖酶酶活的影響如圖9所示，當K2HPO4的添加量一定時，木聚糖酶酶活隨著牛肉膏添加量的增加呈先增大后降低的趨勢。當牛肉膏的添加量一定時，木聚糖酶酶活先增大后降低，這與圖7和圖8顯示的規律相同。此外從響應面圖可分析得出，在各因素之間的交互影響中，3因素中K2HPO4對木聚糖酶酶活響最大，玉米粉次之，牛肉膏最弱。此結果與方差分析表所反映出的結果一致。在此基礎上，通過Design Expert軟件，進行分析計算，可得到紅曲霉M2固態發酵產木聚糖酶的最佳培養基配方為:玉米粉添加量為1.91g、牛肉膏添加量為0.56g、K2HPO4添加量為0.11g，在此條件下木聚糖酶酶活預測值可達1550.62 U/g。結合實際操作的方便和方差分析結果，最終確定培養基配方為:玉米粉添加量為1.90g、牛肉膏添加量為0.55g、K2HPO4添加量為0.10g。

表2 響應面分析試驗結果

圖7 玉米粉和牛肉膏對木聚糖酶酶活影響的 響應面立體分析圖

圖8 玉米粉和K2HPO4對木聚糖酶酶活影響的 響應面立體分析圖

圖9 牛肉膏和K2HPO4對木聚糖酶酶活影響的 響應面立體分析圖

2.3.3 模型的驗證 為了驗證紅曲霉M2固態發酵產木聚糖酶的精確性，對該模型進行驗證實驗。按照此最終培養基參數進行3次重復實驗，可得木聚糖酶酶活平均值為1545.38U/g，實驗值與預測值(1550.62U/g)只相差0.34%。表明此模型是可行有效的，并具有一定的實踐參考價值。

3 結論

通過培養基的篩選，確定了紅曲霉M2固態發酵產木聚糖酶的最佳培養基配方：碳源為玉米粉，氮源為牛肉膏，無機鹽為K2HPO4。在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken實驗設計，對紅曲霉產木聚糖酶培養基進行了優化，通過響應面法對實驗數據進行優化與評價，得到影響木聚糖酶酶活的二次多項式回歸模型，并對該模型進行顯著性檢驗。最終得到優化培養基組成為：玉米粉添加量為1.90g、牛肉膏添加量為0.55g、K2HPO4添加量為0.10g；在此條件下可得到木聚糖酶的最高酶活，預測值為1550.62 U/g，對實驗結果進行驗證，可得木聚糖酶酶活平均值為1545.38U/g，與理論預測值基本一致證明該模型合理可靠。

目前對真菌產木聚糖酶研究主要集中在木霉屬、曲霉屬和毛霉屬。Palaniswamy等[24]用燕麥木聚糖作為底物對53株真菌進行誘導產酶，結果53株都具有很好的木聚糖酶降解活性。其中內切1,4-β-D-木聚糖酶的酶活力為4.41～132.20 U/mL，β-D-木糖苷酶的酶活力為48.72～1510.32 U/mL。朱運平[25]等人對一株產木聚糖酶放線菌的液體發酵條件進行了優化，最佳產酶條件下木聚糖酶活力達1074.8U/mL。而周薇薇[26]等人以黑曲霉(Aspergillus niger FIP-09-24)為研究對象，利用響應面法優化了其工藝，最佳條件下的酶活可達66002U/g。本試驗所得木聚糖酶酶活雖然與周薇薇等人的研究相差較大，這可能是由于酶活定義不同及所選用的菌種不同的緣故。因此后續研究可考慮誘變育種和基因工程育種等方法對紅曲霉進行改造，以期獲得更高的酶活。

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Optimization of solid state fermentation medium ofMonascusM2 for xylanase production by response surface analysis

LIUBo1,WUYing-long1,*,ZHANGXia2,HUANGYa-li2

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The influence of carbon sources,nitrogen source,mineral salt on xylanase activity producted byMonascusM2 in the solid state fermentation was studied.On the base of single factors experiments,response surface analysis was applied to optimize the solid state fermentation medium ofMonascusM2 for xylanase production.The quadratic regression analysis was applied to get the optimal level of main factors(corn meal,beef extract,K2HPO4). Finally determined the optimal medium as follows:corn meal 1.90g,beef extract 0.55g,K2HPO40.10g. Under these optimal conditions,the predicted and experimental production of the activity of xylanase was high up to 1550.62 U/g and 1545.38 U/g,respectively.

Monascus;solid state fermentation;xylanase;Box-Behnken experiment design

2013-07-15 *通訊聯系人

劉波(1987-)，男，碩士研究生，研究方向:功能性食品。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0254-06