基于超細粉碎技術的魚魚皮膠原熱穩定性研究

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(1.江南大學食品裝備工程研究中心,江蘇無錫 214122； 2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

王立慧1,馬倩2,張裕中1

(1.江南大學食品裝備工程研究中心,江蘇無錫 214122； 2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

利用醋酸及胃蛋白酶從經過超細粉碎的鮰魚魚皮中提取了膠原,并對其熱穩定性進行了研究。通過差示量熱掃描分析測定其變性溫度和收縮溫度,并將魚皮膠原在變性溫度和收縮溫度下處理1h,在4℃下復性24h,后通過圓二色譜分析、傅立葉紅外掃描分析和SDS-PAGE凝膠電泳分析其復性情況。結果表明：膠原蛋白的變性溫度為36℃,收縮溫度為65℃；SDS-PAGE凝膠電泳圖譜表明所提取的膠原具備Ⅰ型膠原的特征；熱處理后的膠原蛋白發生了一定程度的變性,且結構不能完全恢復；65℃處理比36℃處理的膠原蛋白復性效果好。本研究可為斑點鮰魚魚皮膠原的應用提供理論依據。

鮰魚魚皮,膠原,變性溫度,收縮溫度,復性

膠原是自然界普遍存在的一類蛋白質,主要存在于動物的皮、骨、牙齒、韌帶、肌腱、韌帶中。從動物皮膚中提取的Ⅰ型膠原蛋白在止血、促進細胞生長、低抗原性等方面有有獨特優勢,因而廣泛應用于醫學、食品、營養保健品等領域[1]。蛋白質分子依靠分子內和分子間的氫鍵來保持它的天然構象,當溫度過高時,氫鍵遭到破壞導致構象發生改變,蛋白的物理、化學性能及許多生物學性能都隨之消失；變性后的蛋白質在4℃下能發生一定程度的復性,性質有所恢復。因此蛋白質的熱穩定性對膠原蛋白的應用具有十分重要的意義。目前關于膠原蛋白的變性溫度、熱收縮溫度國內外學者已有研究[2-5],但關于其復性的情況還未見報道。斑點叉尾鮰魚屬于大型的淡水魚類,湖北省1986年從美國引進并養殖成功。近年來隨著國際市場上斑點叉尾鮰魚加工產品供不應求,國內市場水產品魚類產品加工量巨大,生產過程就產生大量下腳料。從這些下腳料中提取膠原加以利用,既可以提高魚產品加工業的經濟效益,又可以減少下腳料廢棄物造成的環境污染。本文以斑點叉尾魚回魚魚皮為原料提取魚皮膠原,探究其在變性溫度和收縮溫度下變性后的復性情況,旨在為鮰魚魚皮的利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與設備

斑點叉尾鮰魚 江蘇省泰興江泰食品有限公司；標準I型膠原蛋白 博美公司；冰乙酸、NaCl、HCl、AgCl等試劑均為分析純；所用水均為超純水。

差示掃描量熱儀Pyris DSC 美國Perkin Elmer公司；傅立葉變換紅外光譜儀NICOLET IS10 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；圓二色譜儀MOS-450 法國Bio-logic公司；電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；低速離心機DL-5型 上海安亭科學儀器廠；真空冷凍干燥機 美國電熱公司；分析天平AB104-N型 梅特勒-托利多儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1 魚皮膠原蛋白的提取

1.2.1.1 原料前處理 用自來水沖洗斑點叉尾鮰魚,在冰上剝下魚皮,剔除皮下結締組織和脂肪組織。將魚皮切成5mm×5mm的小塊,用濃度為50g/L的NaCl溶液浸泡 6h(低于10℃,間歇攪拌,NaCl溶液與魚皮的體積質量比為5∶1),之后魚皮用冷去離子水(低于10℃)洗滌,并瀝干,用2倍體積(v/m)正己烷浸泡6h,每2h攪拌15min以除去脂肪。通風櫥中瀝干后于冰箱內預凍[6]。

1.2.1.2 膠原提取與純化 準確稱取一定質量的干燥魚皮,以料液比1∶30(W/V)加入0.5mol/L的乙酸,加入一定質量的胃蛋白酶,在4℃下提取24h,間歇攪拌。用多層紗布過濾浸提液,以NaCl鹽析至濃度為0.9mol/L。在4000r/min下離心15min,分離沉淀,并將白色沉淀復溶于0.5mol/L乙酸,重復鹽析沉淀,取得的沉淀依次用0.5mol/L乙酸,0.1mol/L乙酸和去離子水透析,所得魚皮膠原經冷凍干燥至于干燥器中包藏[7]。

1.2.2 膠原變性溫度和收縮溫度的測定

1.2.2.1 變性溫度的測定 將冷凍干燥的膠原干品溶于0.5mol/L乙酸中制成20mg/mL 的膠原溶液,準確量取10mL的溶液密封于液體坩堝內,置于差示掃描量熱儀內,在20～80℃范圍里掃描,升溫速度1℃/min[8]。

1.2.2.2 收縮溫度的測定 準確秤取2～3mg膠原凍干品,密封于固體坩堝內,置于差示掃描量熱儀內,在20～80℃范圍里掃描,升溫速度1℃/min。

1.2.3 膠原復性的研究 用5mol/L乙酸將膠原干品配制成一定濃的膠原溶液,分別在比變性溫度和收縮溫度稍高的36、65℃下作用1h,于4℃下復性24h,用于后續研究。

1.2.3.1 圓二色譜分析 將膠原干品濃度配為0.125mg/mL的溶液,取兩份于36、65℃處理并復性,注入1mm光徑的樣品池,在15℃,190～260nm下對樣品進行掃描,以未處理的溶液做空白。掃描速率為100nm/min,每個點掃描3次,分辨率為1nm,狹縫寬度為1nm。

1.2.3.2 傅立葉紅外掃描分析 將復性24h后的三種溶液再次冷凍干燥成膠原干品,采用傅立葉紅外變換光譜儀做全反射,在4000～400cm-1的波數范圍內測定其吸收光譜,掃描32次,分辨率4cm-1。

1.2.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳 取三份膠原凍干品,分別加1mL去離子水浸泡至透明狀,將其中兩份分別置于36、65℃的水浴鍋中作用1h,后同對照組于4℃下復性24h。分別加1mL 2%(w/v)SDS溶解,以1∶1(v/v)的比例同Sample buffer混合,沸水浴3min,冰浴冷卻。采用5%分離膠,4%濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳[9]。

2 結果與分析

2.1膠原變性溫度與收縮溫度的測定

2.1.1 變性溫度 魚皮膠原溶液DSC曲線如圖1所示。羅非魚魚皮膠原變性的初始溫度為34.5℃,結束溫度為37.6℃,它是由于膠原纖維失水以及發生熱變性的溫度范圍。當膠原處在此溫度范圍中時,膠原的三螺旋結構將會被破壞,膠原活性也會喪失,也就是說膠原將發生結構和性質的改變。圖1中的峰值溫度即為鮰魚皮膠原蛋白的變性溫度,即TD=36℃,比鮑士寶[10]和喻亞麗[11]測得的鮰魚魚皮膠原略高,而低于豬皮膠原的變性溫度(37℃),這主要是由于斑點叉尾魚回魚皮膠原脯氨酸羥基化程度比一般冷水魚類高,而比豬牛膠原低的緣故。

圖1 魚皮膠原溶液DSC曲線

2.1.2 收縮溫度 圖2是魚皮膠原凍干品的DSC溫度曲線。在劇烈的條件下(如60℃以上)膠原三螺旋結構中某些共價鍵會被破壞,如1919年Ewald就曾報道過哺乳動物的皮或腿的膠原纖維在60～70℃的水中猛烈收縮。當其有序結構收縮為初始的1/3時的溫度稱為熱收縮溫度[5]。由圖2中吸收曲線的峰值溫度可知,膠原的熱收縮溫度為65℃,高于劉龍天[12]所提取的牛腱Ⅰ型膠原的收縮溫度(60℃),在這個溫度下魚皮膠原纖維會出現強烈的收縮變性,此時膠原的螺旋體鏈散開,分子量降低。膠原的收縮通常認為是膠原肽鏈間的鍵被弱化或錯位的結果,收縮溫度是膠原結構穩定性的量度。收縮溫度的確定可以為魚皮膠原蛋白在實際生產中的利用和回收提供了理論基礎,即回收膠原蛋白時,溫度條件要低于其收縮溫度。

圖2 魚皮膠原凍干品的DSC溫度曲線

2.2膠原復性的研究

復性操作是采用合理的方法使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢復到正常的具有生物活性的折疊結構。

2.2.1 圓二色譜分析 蛋白質分子具有手性,也具有光學活性,其CD光譜在紫外區段有特征峰,可以用于解析蛋白質的二級結構,如α-螺旋、β-折疊、γ-轉角和變性蛋白質的CD光譜[12]。

圖3是經36℃和65℃處理并復性后的膠原,同對照組(原始膠原)的CD曲線。由圖3 可知,同對照組相比,36℃和65℃處理的膠原DSC曲線的負吸收峰的峰位右移,峰強度均有大幅減弱,并且 36℃下的變化比65℃下變化更明顯。膠原被加熱時,氫鍵斷裂,三螺旋結構解纏繞為形成三條肽鏈,分子結構從有序態變為無序態、從折疊態變為無規卷曲狀態,故變性的膠原內部各二級結構的含量顯著較少。而膠原在收縮溫度下,三條分散的肽鏈會發生收縮,首尾端相互交聯形成氫鍵,因此雖然65℃處理下的二級結構含量遠比對照組膠原少,但仍多于36℃處理的膠原,CD曲線更接近對照組。

由此表明,在變性溫度和收縮溫度的作用下膠原的三螺旋結構受到明顯的破壞,雖經24h的復性,仍無法恢復到原始的結構,且65℃處理后膠原的復性程度高于36℃的膠原。

圖3 不同處理下魚皮膠原的CD曲線

2.2.2 傅立葉紅外分析 天然膠原的三級結構呈獨有的右手三螺旋構型,由3個具有左手螺旋結構的P2亞基相互纏繞而成,每個亞基的三肽重復序列Gly-X-Y中的甘氨酸-NH與相鄰X位亞基的C=O間形成1個直接氫鍵,其余2個C=O以及羥脯氨酸的一OH基團參與分子內或分子間的水橋氫鍵。因此在膠原三螺旋結構的紅外光譜中,酰胺A、酰胺I、酰胺III具有明顯特征。

圖4是三種不同處理下膠原的紅外圖譜,表1是不同樣品在1240、1450cm-1處的透光率。由以上數據可以看到,對照組膠原在3293.339cm-1有一個強而寬的吸收峰,該峰對應于膠原中-NH和-OH的振動,其吸收峰位置與吸收強度與氫鍵締合程度及三螺旋結構有序程度密切相關。2926.312cm-1處為-CH2伸縮振動峰。在1700～1200cm-1間,分別出現了三個吸收峰,它們是蛋白質的酰胺Ⅰ(1635.822cm-1)、酰胺Ⅱ(1538.434 cm-1)及酰胺Ⅲ(1239.040cm-1)的吸收帶,這是蛋白質在紅外光譜中的特征吸收峰。且1240、1450 cm-1附近的峰透光率比值A1240/A1450值為1.011,很接近于1,說明其三股螺旋結構保持得較完整[13]。

圖4 不同處理下魚皮膠原的紅外圖譜

樣品1240cm-11450cm-1對照組69.09467.90836℃76.84675.15565℃73.91672.631

同對照組相比,36℃和65℃處理的膠原的幾個特征吸收峰的峰位有一定程度的左移,透光率均有明顯的減弱,表明各特征峰處的鍵強度減弱。同時65℃變化的幅度小36℃的處理,兩者的A1240/A1450分別為1.022,1.017。表明膠原變性和收縮后,雖經24h的復性仍無法完全恢復到初始結構,部分二級結構被破壞,保留的二級結構使之出現特征峰,但由于含量大大減少,使透過強度減弱。這些變化同樣表明了CD測試中,對于變性溫度和收縮溫度下處理的膠原的分子結構的變化情況：收縮溫度處理后膠原的3條肽鏈在首末端通過氫鍵連接,故比變性后的膠原所含氫鍵多,分子量更大些。

2.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳 圖5所示的是實驗所選取的淡水魚魚皮膠原蛋白的電泳圖譜。圖中對照組膠原含有3條分子質量譜帶分別是膠原的α1組分、α2組分和β組分，其中β組分為α肽鏈的二聚體，由α1和α2組成,且α1鏈的光密度為α2鏈的2倍,符合已報道的對Ⅰ型膠原分子結構的描述,故可以推斷所提取的膠原蛋白分子組成應為(α1)2α2,為Ⅰ型膠原[14-15]。

圖5 不同處理下魚皮膠原的電泳圖譜

由圖5可以看出,經36℃和65℃處理并復性后的膠原結構發生明顯變化,在α鏈以下片區成像顯示鍵斷裂或解旋的碎片,沒有對照組中明顯的α鏈、β鏈。由此可推斷經變性溫度和收縮溫度處理后,膠原的三條鏈被打散,成為分散的α鏈或者α鏈被進一步作用成更加零碎的片段。雖經過復性,仍無法恢復到原來的三螺旋結構,即單純經4℃冷卻的復性效果不如基因工程中的好,因此今后膠原的復性可嘗試添加聚乙二醇等添加劑[16],進一步提高其復性效果。

3 結論

本實驗主要是通過醋酸和胃蛋白酶從斑點叉尾鮰魚皮中提?、裥湍z原蛋白,測定其變性溫度和收縮溫度,并探究其在變性溫度和收縮溫度下處理1h,在4℃下復性24h后結構的變化。

利用差示量熱掃描(DSC)法測得魚皮膠原的變性溫度為36℃、熱收縮溫度為65℃。分別在36℃、65℃下將膠原熱處理1h,在4℃下復性24h后測定其CD光譜、紅外光譜以及SDS-PAGE凝膠電泳,結果均表明：經熱處理后的膠原三螺旋結構受到破壞,二級結構減少,雖經復性仍無法完全恢復到初始結構。另外,膠原變性和熱收縮時結構的變化存在差異：變性時膠原的三螺旋結構解體,成為三條獨立的游離肽鏈；熱收縮時三條肽鏈并不是完全分離,相互間在首末端作用,形成氫鍵,因此,65℃處理膠原的CD光譜、紅外光譜更加接近未處理的膠原。在工業生產中,利用魚皮時需注意環境溫度低于36℃,以免造成魚皮膠原不可恢復的變性。

[1]劉秉慈.膠原蛋白在醫用生物材料中的應用[J].生命的化學,1991,11(4):23-24.

[2]康俊霞,康永鋒,包斌,等.Na+、Ca2+和pH對鯨鯊皮膠原蛋白熱變性溫度的影響[J].食品科學,2011,32(13)：66-70.

[3]何有節,彭必雨.被蒙囿絡合物對膠原熱穩定性的作用[J].皮革科學與工程,1997,7(4)：39-44.

[4]宋瑞瑞,包斌,卜勇士,等.Ⅱ型膠原蛋白的熱穩定性、圓二色性和紅外光譜研究[J].中國海洋藥物,2013,32(1)：55-62.

[5]Nishtar Nishad Fathima,Balaraman Madhan,Jonnalagadda Raghava Rao,etal.Interaction of aldehydes with collagen:effect on thermal,enzymatic and conformational stability[J].Biological Macromolecules,2004,34：241-247.

[6]L S Senaratne,Pyo-JamPark.Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish(Lagocephalus gloveri)skin[J].Bioresource Technology,2006(97):191-197.

[7]戶業麗,吳潔,張瑞，等.酸法提取人工養殖鱘魚皮中膠原蛋白工藝的研究[J].食品科技,2008,(2):109-210.

[8]趙露,劉海英,袁信華,等.斑點叉尾鲴魚皮膠原的提取及其基本特性的研究[J].大連水產學院報,2009,24:423-430.

[9]Motowidlo,Sladewska,Mulkiewicz,etal. Isolation and Characterization of a Thermally Stable Collagen Preparation from The Outer Skin of The Siver[J].Aquaculture，2008,78(13). 130-134.

[10]鮑士寶,王璋,許時嬰,等. 鮰魚魚皮膠原的提取及性質研究[J]食品與發酵工業,2008,34(9):84-88.

[11]喻亞麗,周運濤,何力,等.斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的理化特征研究[J].食品工業科技,2013,34(4)：89-93.

[12]劉龍天.膠原蛋白三螺旋結構及熱穩定性的研究[D].北京：北京協和醫學院,2009.

[13]Plepis A M,Goissis G Das-Gupta D K.Dielectric and Pyroelectric Characterizationof anionic and native collagen[J]. Polymer Engineering and Science,1996,36(24)：2932-2938.

[14]Prabjeet Singh,Soottawat Benjakul,Sajid Maqsood,etal. Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of stripedcatfish(Pangasianodon hypophthalmus)[J]. Food Chemistry,2011,124:97-105.

[15]趙蒼碧,黃玉東,李艷輝. 從牛腱中提取膠原蛋白的研究[J]. 哈爾濱工業大學學報,2004,36(4)：516-519.

[16]牛建樓,劉白玲,王斌.促蛋白復性高分子及其作用機制[J].中國科學院研究生院學報.2012.29(5)：693-698.

Study on the thermal stability of channel catfish skin collagen based on ultrafine grinding

WANGLi-Hui1,MAQian2,ZHANGYu-zhong1

(1.Research Center of Food Equipment,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2. School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Through the method of acid-pepsin,the collagen was extracted from the skin of channel catfish which was grinded,and its thermal stability was studied. The denaturation temperature and shrinkage temperature of skin collagenwere analyzed through differential scanning calorimetric measurements,and the renaturation of collagen was investigated through circular dichroic,FT-IR spectra and SDS-PAGE after it was treated in denaturation temperature and shrinkage temperature for 1h and placed at 4℃ for 24h. The result indicated that the denaturation temperature and shrinkage temperature were respectively 36℃ and 65℃,and the collagen was characterized as type I by SDS-PAGE spectra. The structure of collagen treated in 36℃ and 65℃ was damaged to a certain extent compared with the untreated collagen,and it could’t revert to the original structure. What’s more,the collagen of 36℃ treatment had a better denaturation than that of 65℃ treatment. The research can provide theoretical basis for the use of channel catfish skin collagen(CCSC).

channel catfish skin；collagen;denaturation temperature;shrinkage temperature;renaturation

2013-05-31

王立慧(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：食品加工裝備技術。

江蘇省科技型創新資金項目(BC2010031)。

TS254.9

：A

：1002-0306(2014)01-0070-04