海藻糖和氨基酸之間相互作用的分子動力學模擬

白 姝 常 穎 劉小娟 劉夫鋒，*

(1天津大學化工學院生物工程系，系統生物工程教育部重點實驗室，天津300072;2天津化學化工協同創新中心，天津300072)

1 引言

海藻糖是自然界生物體普遍存在的一種非還原性二糖，它是由兩分子吡喃環葡萄糖通過α，α-1，1糖苷鍵連接形成，化學性質非常穩定.1，2海藻糖具有不同于其它雙糖的獨特而卓越的生物學保護特性，其能夠在極端惡劣(高溫、極端pH、高滲透壓和干燥等)的條件下有效地保護生物大分子結構不被破壞，從而維持生物體的生命過程.3-6因此，海藻糖常作為蛋白質藥物、酶等生物大分子的高效穩定劑.7-9此外，海藻糖還可以抑制折疊中間體的聚集沉淀從而作為蛋白質復性添加劑用于蛋白質的復性領域.10

雖然海藻糖已廣泛應用于蛋白質折疊和聚集的研究領域，11，12但關于海藻糖與生物大分子之間的相互作用機理尚存在很多爭議.目前主要有以下三種假說來解釋海藻糖與生物大分子之間的作用機制:玻璃態假說，水替代假說和優先排阻假說.13，14玻璃態假說認為在極端條件下海藻糖易于在蛋白質周圍形成玻璃態，從而起到保護蛋白質不被極端環境損害.15而水替代假說卻認為在惡劣環境下海藻糖能夠替代蛋白質周圍的水分子并和蛋白質之間形成大量的氫鍵，從而保護蛋白質的結構和功能.16與之相反，優先排阻假說卻認為蛋白質不直接與海藻糖發生相互作用，而是優先與水結合，從而使海藻糖分子從蛋白質的溶劑化層中排阻.因此，相對溶液主體，蛋白質表面水分子增多而海藻糖減少，使得生物大分子周圍的海藻糖濃度比溶液中的低，從而使蛋白質優先水化，其表面張力增加，化學勢升高，是熱力學不利的過程.進一步研究表明，其化學勢的增加與蛋白質的溶劑暴露區域成正比.由于變性態的蛋白質所暴露的溶劑面積更大，因此海藻糖分子的加入使變性態蛋白質的化學勢升高的程度相比自然狀態的更大.從而使天然態蛋白質結構在海藻糖溶液中更穩定.優先排阻學說是目前最被大家所接收的一種假說.

為了從原子和分子角度上解析海藻糖穩定蛋白質的作用機理，本研究選擇常見的20種氨基酸為目標分子，利用全原子分子動力學模擬解析海藻糖與20種常見氨基酸之間的相互作用.眾所周知，蛋白質都是由20種常見氨基酸通過肽鍵連接起來的.當海藻糖與蛋白質的殘基發生相互作用時，這些殘基的N和C端都與它們相鄰的氨基酸連接.因此，為了與實際情況類似，本研究將20種常見氨基酸的兩端都用最簡單的氨基酸——甘氨酸封閉，從而形成三肽分子.但在海藻糖和水分子與氨基酸殘基作用分析過程中，本文僅分析了海藻糖和水與中間殘基氨之間的相互作用.希望如此處理可以使解析出的海藻糖和氨基酸之間的作用機理更具有代表性.此外，相對于利用整個蛋白質為目標分子，這樣處理還可以排除蛋白質的序列和結構(如二級結構和三級結構)對海藻糖和殘基之間作用的影響.本研究首先計算了海藻糖與水和這些氨基酸之間的接觸數來衡量海藻糖同極性、疏水性殘基、肽骨架或氨基酸側鏈之間的相互作用.并根據模擬數據計算得到了海藻糖與這些氨基酸之間的接觸系數CTW.最后，計算了海藻糖分子或水分子同氨基酸殘基間氫鍵鍵能.

2 計算方法

2.1 體系構建

海藻糖分子的三維結構文件從GlycoSciences數據庫(http://www.glycosciences.de/)中獲得，其化學結構式和三維模型如圖1所示.本研究中使用的海藻糖的力場參數(包括原子的電荷)選用文獻17中報道的參數.而所有三肽(GXG，其中X代表常見的20種氨基酸)的初始構象均利用SYBYL軟件中的Biopolymer/Build模塊構建.

首先將三肽放入一個立方體盒子(6 nm×6 nm×6 nm)中，然后將10個海藻糖分子隨機放入該盒子，并與三肽保持一定的距離.隨后將盒子中加滿水，并去除與三肽或海藻糖重疊的水分子.采用三次能量最小化模擬優化該體系:首先，固定三肽和海藻糖分子的結構和位置不變，僅讓水分子的結構和位置發生變化;其次，僅固定三肽分子的結構和位置，使海藻糖和水分子的結構和位置發生變化;最后，使所有的分子都可以自由運動.表1所示為三肽在海藻糖溶液中模擬系統的詳細信息.

圖1 海藻糖結構式Fig.1 Structure of trehalose

本研究中海藻糖溶液的濃度為0.07 mol·L-1，海藻糖濃度的選擇主要基于作者早期的研究結果.18在利用分子動力學(MD)模擬研究海藻糖對多肽構象轉換的結果表明海藻糖溶液濃度對多肽的構象轉換影響很大.當多肽在0.07 mol·L-1濃度的海藻糖溶液中，海藻糖分子能夠促進多肽的構象轉換，而在較高濃度的海藻糖溶液中，反而會抑制多肽的構象轉換.基于此，本研究中海藻糖溶液的濃度也選擇了0.07 mol·L-1.由于本模擬中盒子體積和海藻糖分子個數固定不變，而短肽的體積是變化的，因此盒子中水分子的數量是不相同的.例如，Gly體系中水分子數量最多為6989，而Leu和Glu體系中水分子最少為6981.其他體系中水分子的個數均介于它們之間.從這些數據可以看出，水分子數量的差別很小，僅約為模擬體系中水分子的0.1%.此外，相對于三肽的體積來說，盒子體積足夠大.因此，氨基酸與水分子和海藻糖分子之間的接觸數主要由氨基酸的物理化學性質(如，疏水性和帶電性等)所決定.綜上所述，我們認為模擬體系中水分子數量的微小差別(小于0.1%)對海藻糖和水分子與氨基酸之間的接觸數基本沒有影響.

表1 模擬系統的參數Table 1 Parameters of simulation systems

2.2 體系構建

本研究采用GROMACS 4.0.5分子動力學模擬軟件，19水分子采用SPC模型，20GROMOS 96力場用來描述體系內分子之間的勢能.21范德華作用利用Lenard-Jones函數來計算，非鍵截斷距離設定為1.4 nm，非鍵作用原子列表每4個步長更新一次;采用LINCS算法對形成有化學鍵的原子之間的相對距離進行固定.22長程靜電相互作用利用PME方法進行計算，23格點寬度設為0.12 nm;采用Verlet蛙跳算法對每一步的運動方程進行求解，經過積分得到新的時刻各原子的坐標，步長設為2 fs.在計算過程中采用周期性邊界條件對于利用有限的計算單元模擬溶液系統，消除邊界條件是必要的.所有MD模擬均在等溫等壓系綜下進行，溫度為300 K，通過vrescale方法24控制溫度，時間常數設為0.1 ps.壓力為1.01×105Pa，壓力控制采用Berendsen方法，壓力耦合常數為0.5 ps.所有分子動力學模擬計算均在曙光TC2600刀片服務器(每刀片包括4路4核的AMD Opteron 8347HE CPU和8G內存)上完成(Dawning，中國天津).

2.3 模擬分析

2.3.1 接觸數

接觸數是指分子間發生作用的原子接觸個數，該參數常被用來表征兩分子之間相互作用的強弱.25本研究中分子之間的接觸數由GROMACS軟件自帶的g_mindist程序完成.當兩個原子間的間距小于0.35 nm時，才認為原子間相互接觸，視作一個接觸數.

2.3.2 接觸系數

由于這20種氨基酸含有不同的原子個數，因此模擬系統中海藻糖和水分子原子總數差異較大，因此為了準確量化每種氨基酸分子同海藻糖或水分子結合作用的相對大小，本研究又定義了氨基酸的接觸系數CTW:

其中，NX-T和NX-W分別代表氨基酸X同海藻糖分子或水分子的原子接觸數.MT代表海藻糖分子的總原子數，其為31.MW代表水的總原子數.

CTW數值越大，表明該氨基酸和海藻糖分子的結合作用更強.分子動力學軌跡的顯示分析和構象圖均用Visual Molecular Dynamics(VMD)(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)軟件完成.

2.3.3 氫鍵鍵能計算

氫鍵鍵能的計算利用GROMACS 4.0.5軟件自帶的g_hbond程序計算.首先，計算每種氨基酸同海藻糖或水分子之間的氫鍵距離隨模擬時間的變動.然后利用經驗公式(2)估算出氫鍵鍵能(E):

其中，d(H??A)表示供體上的氫原子和受體原子之間的距離.值得注意的是，通過公式(2)計算得到的是孤立氫鍵的能量，是僅通過氫鍵供體和受體之間的距離估算的氫鍵鍵能，并不十分精確.也就是說，它們不同于蛋白質溶液中實際的氫鍵能量.但利用該方法計算氫鍵能量非常簡單，且已有大量研究證明該方法可以用于表示分子之間的氫鍵強弱.26-28因此本研究也用它來衡量這些氨基酸和水和海藻糖之間形成氫鍵的強弱.

3 結果與討論

3.1 海藻糖、水和氨基酸整體的接觸數

首先分別計算氨基酸-海藻糖以及氨基酸-水之間的接觸數來表征氨基酸分子與海藻糖和水分子之間的作用力的強弱以及氨基酸的優先作用傾向.眾所周知，接觸數越大，表明分子間的結合作用越強.反之，分子間的結合作用越弱.圖2所示為海藻糖和水分別與這20種常見氨基酸的接觸數.從圖2可以看出，所有氨基酸和水之間的接觸數均遠大于其和海藻糖之間的接觸數.這說明這些氨基酸主要和水分子優先結合，而對海藻糖分子優先排阻.其中，酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和組氨酸與海藻糖之間的接觸數均為零，即這些氨基酸和海藻糖之間沒有任何直接作用.這主要是因為這些氨基酸的側鏈均為極性基團，它們會優先和水分子作用而對海藻糖分子排阻.而脯氨酸側鏈雖然為疏水性基團，但是其側鏈原子與骨架C、N原子共同形成了一個五元環，從而產生較大的空間位阻，從而與海藻糖之間沒有直接作用，因此其與海藻糖之間的接觸數也為零.

圖2 氨基酸與海藻糖和水之間的接觸數Fig.2 Number of contacts between amino acids and trehalose and water

從圖2可以看出，在20種常見氨基酸中，色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖之間的接觸數最大，表明它們與海藻糖有較強的相互作用.主要原因是這兩種氨基酸均為非極性氨基酸，且側鏈均帶有苯環，從而和海藻糖的六圓環發生相互作用.圖3為色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖相互作用的示意圖.從該圖可以看出，色氨酸和苯丙氨酸側鏈上的苯環和海藻糖分子的六圓環平行堆疊(如圖3中橢圓所標示)，從而使色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖的作用力較其它氨基酸強.另外，雖然這些色氨酸和苯丙氨酸之間的接觸數遠大于其它氨基酸，但氨基酸-海藻糖之間的接觸數也小于這些氨基酸和水分子之間的接觸數.即，這些氨基酸也優于和水分子發生相互作用.

從圖2可以看出，所有氨基酸均與水分子接觸，且與水分子的接觸數均大于它們與海藻糖之間的接觸數.其主要原因是所有氨基酸均含有極性主鏈―NH―CO―.其中，酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸等極性氨基酸，它們和水分子的接觸數均大于60.在所有氨基酸中，脯氨酸和水分子的接觸數是最小的，主要原因除了脯氨酸為疏水性氨基酸之外，還與其結構特殊有關.脯氨酸特殊的環狀結構使其缺少極性基團―NH，因此脯氨酸和水分子的接觸數在20種常見氨基酸中是最小的.

圖3 海藻糖與色氨酸(a)和苯丙氨酸(b)之間直接相互作用示意圖Fig.3 Snapshots of the direct interaction between trehalose and tryptophane(a)and phenylalanine(b)

綜上所述，所有氨基酸與水分子的接觸數均大于它們和海藻糖分子之間的接觸數.色氨酸和苯丙氨酸與海藻糖之間的接觸數遠大于其他的氨基酸與海藻糖之間的接觸數，但其與水分子之間的接觸數也大于其與海藻糖之間的接觸數.此外，酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸等極性氨基酸和水分子的接觸數最多.

3.2 海藻糖和水分別與氨基酸骨架和側鏈之間的接觸數

為了進一步解析氨基酸的骨架和側鏈分別與海藻糖和水之間相互作用，我們又分別計算了20種常見氨基酸的骨架和側鏈分別與海藻糖和水之間的接觸數，如圖4和圖5所示.

圖4所示為氨基酸的主鏈和側鏈與海藻糖之間的接觸數.從圖4可以看出，所有氨基酸骨架和海藻糖的接觸數均很小，最大不超2個.海藻糖主要和氨基酸的側鏈接觸.這說明與氨基酸側鏈相比，其骨架和海藻糖的作用較小.眾所周知，所有氨基酸的骨架原子完全一致，但圖4顯示各氨基酸骨架和海藻糖的接觸數存在一些差別.這說明這些氨基酸的側鏈結構會影響它們的骨架和海藻糖的結合作用.此外，由于甘氨酸無側鏈，故側鏈對應的接觸數為零.酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和組氨酸無論是骨架還是側鏈，與海藻糖接觸數均為零，故其整體與海藻糖沒有任何作用，與圖2結果相符.

圖4 氨基酸的主鏈和側鏈與海藻糖之間的接觸數Fig.4 Number of contacts between backbone and side chain of amino acids and trehalose

在其它氨基酸中，大部分側鏈和海藻糖的接觸數都大于其骨架和海藻糖的接觸數，這說明氨基酸的側鏈在氨基酸和海藻糖的結合作用中貢獻較大，是氨基酸和海藻糖的主要作用位點.尤其是，色氨酸和苯丙氨酸的側鏈與海藻糖的接觸數最大，結合作用最強.這主要是因為其側鏈均為非極性基團，且帶有苯環，更易與海藻糖結合(圖3所示).從圖4可以看出，天冬酰胺和谷氨酰胺的側鏈和海藻糖的接觸數有較大差異.例如，天冬酰胺的側鏈和海藻糖的接觸數為3.25，而谷氨酰胺的側鏈和海藻糖的接觸數為10.56.主要原因為谷氨酰胺的側鏈比天冬酰胺的側鏈多一個亞甲基，從而使谷氨酰胺的側鏈的疏水性比天冬酰胺高，從而極大提高了側鏈和海藻糖的親和作用.

綜上所述，側鏈是氨基酸和海藻糖的主要作用位點，而氨基酸的骨架和海藻糖之間的作用卻較弱.尤其是非極性、芳香族氨基酸的側鏈和海藻糖的作用最強.

圖5所示為水分子與氨基酸主鏈和側鏈之間的接觸數.從圖5可以看出，所有氨基酸骨架和水的接觸數由于側鏈類型、空間結構等的不同，略有差異，但最大不超過11.除疏水性氨基酸纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、胱氨酸、絲氨酸和脯氨酸之外，其余氨基酸側鏈和水的接觸數均大于其骨架和水的接觸數.例如，酪氨酸的側鏈和水分子之間的接觸數最大，可達到84.這說明骨架和水的結合作用對于氨基酸和水分子之間的作用影響差別不大.相反，對于大部分氨基酸，側鏈是氨基酸和水分子的主要作用位點.由于天冬酰胺的側鏈比谷氨酰胺的側鏈少一個亞甲基，從而使其側鏈的親水性要好于谷氨酰胺的.因此它和水分子的接觸數(39.68)要稍大于谷氨酰胺的側鏈和水分子之間接觸數(32.15).綜上所述，側鏈是除了疏水性氨基酸之外的氨基酸和水分子的主要作用位點，比骨架和水分子之間的作用力要強.此外，骨架對側鏈和海藻糖的結合作用也有一定影響.

圖5 氨基酸的主鏈和側鏈與水分子之間的接觸數Fig.5 Number of contacts between backbone and side chain of amino acids and water

3.3 氨基酸的接觸系數

考慮到模擬系統中海藻糖和水原子總數的差異對接觸數會有所影響，進一步引入CTW來分析每種氨基酸分別與海藻糖和水分子的結合傾向.圖6所示為每種氨基酸的接觸系數CTW.

從圖6可以看出，色氨酸和苯丙氨酸的接觸系數最大，分別為41和38.其次為谷氨酰胺和半胱氨酸，它們的接觸系數均大于20.蛋氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、異亮氨酸、丙氨酸，甘氨酸和纈氨酸的接觸系數大于10.酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和組氨酸因為其與海藻糖間的接觸數都為0，故對應的CTW值為零.此處以主鏈的接觸系數作為比較標準是因為優先排阻學說認為蛋白質的優先排阻主要是由蛋白質的主鏈所引起的.因此，海藻糖與主鏈接觸數很少，而水分子與主鏈的接觸數相對于各氨基酸基本相同，所以20種常見氨基酸主鏈的接觸系數的平均值為69.8.基于上述分析，若各氨基酸的接觸系數小于69.8表明該氨基酸更易于與水分子結合，而對海藻糖分子進行排阻.從圖6可以看出所有氨基酸對應的接觸系數均遠小于69.8，即這些氨基酸均和水分子優先結合，而對海藻糖優先排阻.綜上所述，海藻糖的優先排阻主要由氨基酸的主鏈和側鏈相互作用的結果.

圖6 氨基酸的接觸系數(CTW)Fig.6 Contact coefficient(CTW)for each amino acid

基于以上分析，本研究結果支持優先排阻學說.當蛋白質在自然狀態時，蛋白質的疏水氨基酸會在疏水相互作用影響下發生疏水塌縮，而親水性氨基酸側鏈會分布在蛋白質的表面，因此這些親水性的側鏈會優先和水分子發生相互作用，而對海藻糖優先發生排阻作用.當變性狀態的蛋白質在海藻糖溶液中，這些氨基酸和水分子之間的親合作用均比它們和海藻糖之間的作用更強，即這些氨基酸更易于和水分子發生相互作用，而排阻海藻糖分子，從而造成蛋白質對海藻糖分子的排阻.當然，蛋白質在海藻糖溶液中，海藻糖和水與氨基酸之間的相互作用比本研究體系要復雜.蛋白質的序列、二級和三級結構都會對海藻糖和水與氨基酸殘基之間作用有影響.將來在研究海藻糖對蛋白質穩定性的影響過程中，考慮利用二級結構內稟傾向性受溶劑調控的分析方法詳細研究海藻糖對蛋白質結構穩定性的影響機制.29此外，由于氨基酸在蛋白質分子中的環境與本文選擇的三肽系統有顯著區別，為了更真實地了解海藻糖對蛋白質的穩定性的影響.作者將在后期研究中開展海藻糖穩定蛋白質的作用機理.考慮到蛋白質分子體系的復雜性，為了在更大的構型空間上取樣，將采用更為有效的構象采樣方法——副本交換分子動力學方法來研究海藻糖對蛋白質穩定性的分子機理.30，31

3.4 氫鍵鍵能

從圖1可以看出，海藻糖含有8個羥基，因此氫鍵是氨基酸和海藻糖與水分子之間的主要作用力之一，對氨基酸和海藻糖與水之間的結合作用具有重大貢獻.下面通過計算海藻糖和水與氨基酸之間整體氫鍵鍵能的平均值來衡量常用20種氨基酸和海藻糖分子間氫鍵作用的強弱(表2).從表2可以看出，所有氨基酸和水分子間的氫鍵鍵能均遠大于氨基酸和海藻糖間的氫鍵鍵能.例如，所有氨基酸和水分子之間氫鍵鍵能的平均值為24.45 kJ·mol-1，而所有氨基酸和海藻糖分子之間的氫鍵鍵能的平均值僅為6.85 kJ·mol-1.另外，氨基酸同水分子間的氫鍵鍵能最大為酪氨酸和水分子之間的氫鍵，其鍵能為30.76 kJ·mol-1，最小鍵能為賴氨酸和水分子之間的氫鍵，其鍵能為20.75 kJ·mol-1.而氨基酸和海藻糖間的氫鍵鍵能最大的為天冬氨酸和海藻糖分子之間的氫鍵，它們的鍵能僅為12.27 kJ·mol-1.其中，谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸無論是主鏈還是側鏈，和海藻糖間的氫鍵鍵能均為零，即這些氨基酸和海藻糖之間沒有氫鍵作用，這與圖4的結果一致.而谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸和水分子之間均發生氫鍵作用.而帶電氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸，賴氨酸和精氨酸)和極性氨基酸(絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸)的主鏈和側鏈均和水分子有氫鍵.而這些帶電和極性氨基酸的側鏈和水的氫鍵鍵能大于主鏈和水的氫鍵鍵能.也就是說，這些氨基酸的側鏈更易與水形成氫鍵，側鏈上的極性基團是氨基酸和水的主要作用位點.與之相反，其他氨基酸的側鏈和水的氫鍵鍵能均小于它們主鏈和水的氫鍵鍵能，也就是說這些氨基酸主要是通過主鏈和水發生氫鍵作用.因此，氫鍵是氨基酸和水的主要結合力.此外，水比海藻糖更易形成氫鍵，且極性氨基酸側鏈的極性基團和主鏈是氨基酸和水的主要作用位點.

表2 氨基酸的主鏈和側鏈與海藻糖和水之間氫鍵鍵能的平均值Table 2 Average values of energies of hydrogen bonds between each amino acid including its backbones and side chains and trehalose and water molecules

4 結論

選擇兩端以甘氨酸封閉的三肽作為模型蛋白質，利用全原子分子動力學模擬方法考察海藻糖和氨基酸之間的相互作用，以便從原子和分子水平上深入闡釋海藻糖對蛋白質穩定的作用機制.結果表明，相對于海藻糖分子所有氨基酸均優先和水分子結合.其中，極性帶電氨基酸和水的結合作用較強;而相較于其它氨基酸，非極性芳香氨基酸和海藻糖的結合作用較強，而氨基酸的側鏈是其與海藻糖的主要作用位點.氨基酸骨架和海藻糖與水分子的作用均較側鏈弱，而氨基酸的側鏈是除丙氨酸、纈氨酸之外的所有氨基酸和水分子的主要作用位點.非極性芳香氨基酸的側鏈和海藻糖的作用較極性氨基酸側鏈和海藻糖的作用強，而和水分子的作用卻較極性氨基酸側鏈和水分子的作用弱;氨基酸和海藻糖和水之間均形成氫鍵，但海藻糖-氨基酸之間的氫鍵弱于氨基酸和水之間的氫鍵，極性氨基酸側鏈的極性基團和主鏈是氨基酸和水的主要作用位點.其中，谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸和海藻糖間的氫鍵鍵能均為零.綜上所述，僅從氨基酸殘基角度分析，本研究結果支持海藻糖和蛋白質之間的作用機理為優先排阻學說.但需要進一步說明的是，由于本研究中選用的三肽與實際溶液中的蛋白質結構差別較大，在隨后的研究工作中，我們會繼續研究蛋白質的骨架、側鏈和整個蛋白質與海藻糖相互作用的機理，希望基于這些研究可以對海藻糖穩定蛋白質的作用機理有新的認識.

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