雙甲五靈膠囊抑制大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化的研究

羅超，王平，徐貴森，沈才飛

（1.中國人民解放軍成都軍區總醫院急診科，成都 610083；2.中國人民解放軍成都軍區總醫院消化內科，成都 610083）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，其發病與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關，病理學改變與酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）類似［1，2］。NAFLD 疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）和非酒精性脂肪性肝硬化3種主要類型，其中NASH是NAFLD進展的重要中間階段［3，4］。

非酒精性脂肪性肝纖維化是NASH進展為肝硬化甚至肝癌的必經階段，也是其進展為肝硬化的中間環節和限速步驟。因此，探尋有效抑制NASH肝纖維化的措施是NASH治療的一個關鍵環節。近年來，中醫藥抗肝纖維化治療研究已取得較多進展，部分已經進入臨床應用階段，如扶正化瘀319膠囊、復方861沖劑、復方鱉甲軟肝片等［5］。雙甲五靈膠囊是國內自主研發的一種抗肝纖維化治療的中成藥，其有效性已在長期臨床實踐中得到證實［6］。在本研究中，筆者利用大鼠模型探討雙甲五靈膠囊抑制NASH進展及抗纖維化作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

健康雄性成年SD大鼠40只，體質量（200±20）g，由華西醫科大學動物實驗中心提供。雙甲五靈膠囊購自第四軍醫大學唐都醫院藥劑科（其主要成分為柴胡、五味子、丹參、黃芪、靈芝、鱉甲、穿山甲等9味中藥）。

1.2 NASH大鼠模型的構建

以每天25g/只 高脂飼料喂養構建NASH大鼠模型，其余大鼠以普通飼料補足，自由飲水。高脂飼料配方：豬油10%，膽固醇2%，基礎飼料88%［7］。

1.3 動物分組及給藥

將40只SD大鼠隨機分為3組：1）正常大鼠對照組，10只，以正常飼料喂養；2）空白治療模型組，15只，以高脂飼料喂養，不做其他處理；3）雙甲五靈治療組，15只，以高脂飼料喂養4w之后，同時喂養雙甲五靈膠囊8w（平均2粒/d·只），實驗共持續12w。期間大鼠自由進食進水，飼養于（20±2）℃明暗各12h的清潔級動物實驗室。實驗結束前夜禁食，麻醉狀態下處死大鼠，稱取大鼠體質量、肝濕重，常規制作血清標本及肝臟標本，保存于-80℃冰箱。

1.4 血清肝功能指標及肝組織TG含量檢測

以日立SBA-300型全自動生化分析儀測量血清ALT、AST、TBIL、ALP及肝組織TG含量。

1.5 肝纖維化血清學指標的測定

采用放射免疫法測定血清透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅳ膠原（Ⅳ-C）和Ⅲ型前膠原（PCⅢ），操作按照試劑盒說明書進行。

1.6 病理學診斷

肝組織切片后以天狼星紅－苦味酸染色，光鏡下觀察大鼠肝組織膠原沉積情況，并以半定量計分系統（SSS）判斷肝組織炎癥活動度及纖維增生水平［8］。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，行studentt檢驗或ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雙甲五靈膠囊治療對大鼠體質量、肝濕重和肝TG含量等指標的影響

與正常大鼠對照組相比，空白治療模型組大鼠體質量、肝濕重和肝TG含量均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05），符合脂肪肝表現；與空白治療模型組相比，雙甲五靈治療組大鼠體質量、肝濕重和肝TG含量則明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 大鼠體質量、肝濕重、肝TG含量等指標比較

2.2 雙甲五靈膠囊治療對大鼠肝功能指標的影響

與正常大鼠對照組相比，空白治療模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL及ALP均有顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；而造模大鼠在給予雙甲五靈膠囊治療后，其4項血清學指標均有顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 肝功能指標比較

2.3 肝纖維化血清學指標的變化

雙甲五靈膠囊治療對大鼠肝纖維化血清學指標的影響結果顯示：與正常大鼠對照組相比，空白治療模型組大鼠肝纖維化血清學指標HA、LN、Ⅳ-C及PCⅢ均有顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；但在給予雙甲五靈膠囊治療的造模大鼠中，肝纖維化血清學4項指標均有顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表3）。

表3 肝纖維化血清學指標比較

2.4 肝纖維化病理學指標

為了進一步在病理學上明確雙甲五靈膠囊治療對NASH大鼠肝纖維化的抑制作用，筆者在實驗終點取所有大鼠肝臟組織并以天狼星紅－苦味酸染色法觀察肝組織病理形態學變化，結果顯示：與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠正常肝小葉結構破壞，存在大量纖維結締組織增生；與空白治療模型組相比，雙甲五靈治療組肝組織纖維增生程度顯著減輕（見圖1）。根據SSS計分，雙甲五靈治療組大鼠炎癥活動度及纖維化程度在統計學上也顯著低于空白治療模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），但較正常大鼠對照組，其炎癥活動度及纖維化程度SSS計分仍較高，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表4）。

圖1 肝組織病理形態學變化（天狼星紅－苦味酸染色法）

表4 炎癥活動度及纖維化程度SSS計分的比較

3 討論

隨著肥胖及其相關代謝綜合征全球化的流行趨勢，NAFLD現已成為歐美等發達國家主要的慢性肝病，普通成人NAFLD患病率為10%～30%，其中10%～20%為NASH，后者10年內發生肝硬化的概率高達25%。隨著人民生活富裕程度的提高，我國肥胖人群愈來愈龐大。流行病學調查顯示，在肥胖人群中，NAFLD發病率在50%以上。因此，NAFLD的防治已成為我國一個重大公共健康問題［9］。NASH是NAFLD發病過程中的關鍵環節，若不加控制，其將向肝纖維化及肝硬化發展。因此，控制NASH患者的肝纖維化過程尤為重要。

祖國傳統醫學應用活血化瘀原理治療肝硬化已經取得了較好的效果，提示某些中藥成份具有抗纖維化作用，如黃芪、丹參等［10，11］。臨床研究表明，長期使用活血化瘀藥物，可以有效阻止肝纖維化的進展。雙甲五靈膠囊是在五靈丸活血化瘀基礎上輔以軟肝散結之中藥而成，其主要成份包括柴胡、黃芪、丹參、靈芝、五味子、鱉甲、穿山甲等，實驗室及多年臨床實踐表明，雙甲五靈膠囊是一種有效的抗肝纖維化的中成藥物［6，12，13］。

在本研究中，筆者初步探討了雙甲五靈膠囊對NASH大鼠肝纖維化進程的抑制作用，結果顯示：雙甲五靈膠囊可以在大體、肝功能指標、肝纖維化血清學指標、肝纖維化病理學指標如炎癥活動度及纖維化程度等多個層次改善NASH大鼠肝纖維化的進程。這一結果提示：雙甲五靈膠囊對肝纖維化的抑制作用不僅僅局限于病毒性肝炎由于炎癥壞死所致的肝纖維化，其也可以應用于NASH由于游離脂肪酸等有毒物質導致的肝纖維化。雖然筆者的研究顯示雙甲五靈膠囊并不能完全抑制NASH的肝纖維化進程，但若聯合應用飲食治療、運動治療、行為修正治療或其他藥物治療等綜合措施，可能會取得更好的治療效果。雙甲五靈膠囊抑制NASH大鼠肝纖維化進程的機制目前尚不明確，筆者下一步擬在雙甲五靈膠囊對NASH大鼠肝星狀細胞活化、膠原蛋白的生成與降解平衡、過氧化物清除及氧化應激損傷等多個方面進行探討，以期能從循證醫學的角度證實雙甲五靈膠囊在NASH治療中的作用，為祖國傳統醫學的發展做出貢獻。

［1］中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）［J］.現代醫藥衛生，2011，27（5）：641-644.

［2］Patell R，Dosi R，Joshi H，etal.Non-Alcoholic Fatty Liver Disease（NAFLD）in Obesity［J］.J Clin Diagn Res，2014，8（1）：62-66.

［3］Schuppan D，Schattenberg JM.Non-alcoholic steatohepatitis：pathogenesis and novel therapeutic approaches ［J］.J Gastroenterol Hepatol，2013，28 （11）：68-76.

［4］Bohinc BN，Diehl AM.Mechanisms of disease progression in NASH：new paradigms［J］.Clin Liver Dis，2012，16（3）：549-565.

［5］Gong Y.Identifying the targets for treatment of liver fibrosis and hepatocellular carcinoma from both Western medicine and Chinese medicine［J］.Chin J Integr Med，2012，18（4）：245-249.

［6］謝玉梅，聶青和，康文臻，等.中藥雙甲五靈沖劑對免疫性肝纖維化大鼠抗肝纖維化的分子機制研究［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2009，18（2）：154-158.

［7］徐輝，王旭霞，聞勤生，等.甲氰咪胍在非酒精性脂肪性肝炎進展過程中對肝纖維化的影響［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2006，15（2）：109-112.

［8］曾民德，王泰齡，王寶恩.肝纖維化診斷及療效評估共識［J］.肝臟，2002，7（2）：3-4.

［9］Xiao J，Guo R，Fung ML，etal.Therapeutic approaches to non-alcoholic fatty liver disease：past achievements and future challenges［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2013，12（2）：125-135.

［10］Shi KQ，Fan YC，Liu WY，etal.Traditional Chinese medicines benefit to nonalcoholic fatty liver disease：a systematic review and meta-analysis［J］.Mol Biol Rep，2012，39 （10）：9715-9722.

［11］Dong H，Lu FE，Zhao L.Chinese herbal medicine in the treatment of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Chin J Integr Med，2012，18（2）：152-160.

［12］許佳平，白憲光.雙甲五靈膠囊治療肝纖維化的臨床研究［J］.中國中西醫結合消化雜志，2002，10（3）：159-161.

［13］張巖，李艷紅，謝玉梅，等.拉米夫定聯合雙甲五靈膠囊的抗肝纖維化作用［J］.中西醫結合肝病雜志，2004，14（6）：330-331.