天麻種子自然萌發和生長特性

冉孝琴+桂陽+張麗娜+楊通靜+朱國勝

摘要：為了揭示烏天麻和紅天麻種子自然萌發和生長發育特性，建立野生萌發菌收集方法，采用4 ℃冷藏、室溫貯藏、新鮮種子3種不同貯藏方式的紅天麻和烏天麻種子在原生地播種，通過不同時間取樣，觀察統計種子的萌發率、死亡率和萌發生長指數。結果表明，天麻種子6月播種，8月有較高的萌發率，9月種子萌發生長指數高；不同貯藏方式下的天麻種子其萌發率、死亡率、生長指數差異顯著；常溫貯藏種子萌發生長指數顯著小于4 ℃冷藏種子與新鮮種子，4 ℃冷藏種子與新鮮種子之間萌發生長指數相近。因此在6月選擇新鮮種子或短時間冷藏種子播種有利于種子的萌發，在9月利于采樣，可以獲得理想的萌發菌分離材料。

關鍵詞：天麻（Gastrodia elata）；萌發菌；原生地；萌發率；萌發生長指數

中圖分類號：S682.31；Q945.34文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2325-05

The Natural Germination-Growth Characteristics of Gastrodia elata Seeds

RAN Xiao-qin1，2，GUI Yang2，ZHANG Li-na2，YANG Tong-jing2，ZHU Guo-sheng2

（1.College of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China； 2.Institute of Modern Chinese Medicinal Materials，Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Guiyang 550006，China）

Abstract： To reveal the seed germination and growing characteristics of seeds of G. elata f.elata and G.elata f.glauca S.Chow and to establish the wild G. elata germinating fungi collection method， fresh seeds and seeds preservted under 4 ℃ or room temperature of G.elata f.elata and G.elata f.glauca S.Chow were sowned and sampled in situ. Methods of observation and statistics were used to study seed mortality rate，germination rate and germination-growth index.Results showed that seeds sowned in June had higher seed germination rate in August and higher germination- growth index in September.There were significant differences of germination rate，mortality rate and germination-growth index among seeds stored under three different temperature. Germination-growth index of seeds stored under room temperature was significant lower than that of fresh seeds and those stored under 4 ℃. There was no significant difference of germination-growth index between fresh seed and those stored under 4 ℃. Fresh seeds and seeds stored under 4 ℃ for 20 days were used to sow in June，good germinating fungi separation material could be collected in September.

Key words： Gastrodia elata；germinating fungi；in situ；germination rate；germination-growth index

基金項目：貴州省優秀青年科技人才培養對象專項資金項目[黔科合人字（2011）35號]；貴州省科技計劃項目[黔科合院所創能（2010）4002]；貴州省農業科學院博士科研啟動項目[黔農科院人才啟動項目（2009）006號]

天麻（Gastrodia elata）為蘭科天麻屬（Gastrodia）多年生寄生草本，無根，無綠色葉片，不能進行光合作用，營異養生活[1]。天麻全世界約有20種以上，分布于熱帶、亞熱帶、溫帶以及寒溫帶山地[2]。中國天麻屬植物已發現6個種，即天麻（G. elata）、原天麻（G. angusta）、細天麻（G. gracilis）、南天麻（G. javanica）、疣天麻（G. tuberculata）。天麻在西南地區大多生長于海拔700～2 800 m的闊葉落葉林山區[3，4]。天麻干燥塊莖具有平肝熄風、止痙之功效，用于治療頭暈目眩、小兒驚風、癲癇、肢體麻木及半身不遂等癥[5，6]。近年來的研究發現，天麻還具有增智、健腦和延緩衰老的作用，對老年性癡呆癥具有一定的療效[7，8]。因此，天麻越來越受到人們的關注。

由于生態環境的不斷破壞和人類大肆采挖，使得野生天麻資源日益減少，目前天麻已被列入國家重點保護野生植物名錄。天麻在中國普遍栽培，紅天麻和烏天麻為主栽品種。天麻種子小，發育不全，沒有胚乳，自身貯存的營養不能滿足其萌發和生長需要，需與小菇屬真菌共生才能正常萌發生長形成原球莖，但不同的小菇屬真菌對天麻種子萌發和生長的作用差異較大[9，10]。貴州省農業生物技術重點實驗室人員在貴州天麻產區的調查結果也表明，不同天麻種子與不同萌發菌之間的親和性不同，同種萌發菌對同種天麻種子萌發和生長效果還受自然環境的影響，在實際生產中往往因萌發菌菌種與當地天麻種子的親和性不高或不適宜當地的生態環境而導致空窩率高，最終影響到天麻有性繁殖的產量，很多產地不得不通過增加種子的數量來降低風險，每平方米用種量最多的可達到25個蒴果，大大增加了成本[11]。為此搜集不同天麻產區萌發菌資源，選育出適宜不同區域不同種天麻的高親和性萌發菌菌株已成為減少蒴果用量、降低成本、提高效益的必由之路。Rasmussen等[12]建立的種子袋原生地播種技術使得回收微小蘭科植物種子成為可能，為蘭科植物種子在自然界中萌發特性研究提供了技術保障。目前，種子袋原生地播種法已成功應用于多種蘭科植物種子自然萌發特性的研究，定期回收種子袋檢測種子的萌發情況，可調查種子的萌發啟動時間、種子萌發形態變化過程及種子在土壤中的存活時期[13-15]；可調查種子萌發與地點分布的相關性[16-18]；可誘捕共生菌，調查種子萌發與共生菌的相關性[19-21]。迄今為止，還沒有關于天麻種子原生地自然萌發特性和利用種子袋原生地共生萌發誘捕野生萌發菌的相關報道。本研究采用原生地種子袋播種法，將不同貯藏方式的天麻種子在原生地播種，并在不同時間取樣觀察種子萌發生長變化情況，總結出天麻種子自然萌發和生長發育特性，建立野生萌發菌收集方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料分別為紅天麻與烏天麻。采集授粉后20～21 d的蒴果，紅天麻蒴果顏色為橙紅色，烏天麻蒴果的顏色為橙黃色，成熟蒴果的六條縱縫明顯，手捏起來有點軟，可聽見微弱開裂的聲音。

1.2試驗設計

試驗設置3種不同的種子貯藏方式，以考察不同貯藏方式對種子播種后的影響，各貯藏方式分別為：①4 ℃冷藏種子。每種天麻各100粒蒴果，每25粒蒴果裝1信封中，蒴果開裂后，將果殼取出，信封不封口，放入冰箱4 ℃冷藏20 d備用。②常溫貯藏種子。同4 ℃冷藏種子采集方法，每25粒放在一個平皿內，蒴果采下來一天就會開裂，開裂后將蒴果殼拿出，防止霉變，放置20 d備用。③新鮮種子。采集蒴果，不貯藏，立即用。

1.3試驗方法

1.3.1播種前種子質量的檢測將4 ℃冷藏、室溫貯藏和新鮮的天麻種子分別取出，各自混合均勻，取適量種子加入1.5 mL離心管中的0.25 mL刻度處，加入1%TTC溶液1 mL，30 ℃黑暗靜置48 h后，用膠頭滴管吹打使種子混勻，混勻后吸取種子滴在載玻片中央，用吸水紙吸去染液，置于體視顯微鏡下，隨機挑選3個視野，觀察種子染色情況，有活力種子種胚被染成橙色或者粉紅色，無活力種子種胚不著色或染成黃色，分別計數每個視野的種子總數和有活力種子總數，并計算種子活力。種子活力=（有活力種子總數/統計種子總數）×100%[22]。每個樣品設3次重復。

1.3.2原生地播種參考原生地播種法[12]，采用300目尼龍網（孔徑約為20 μm）制作成7 cm×8 cm網袋，一端開口，播種前分別將種子袋在去離子水中浸泡5 min，將蒴果種子混合均勻后，用小勺把種子從網袋開口端撒入，稀疏平鋪種子袋一層，約為1 000粒種子。于2012年6月24日在天麻野生分布區貴州省雷山縣方祥鄉落葉闊葉林中（108°12′50″E，26°25′59″N，海拔1 598.60 m，陽坡坡度5°～10°）進行播種。將種子裝好后，扒開淺層腐殖土及落葉，到落葉與地面土壤接觸的那一層時，將種子袋水平鋪開，覆蓋腐殖土約15 cm，然后再蓋10 cm雜草保濕保溫。

1.3.3數據統計與分析于2012年8月27日、9月20日、10月23日、11月19日、12月22日進行取樣，將取出的種子袋裝入有泥土的袋子中帶回實驗室觀察。觀察時先用毛刷刷去種子袋表面泥土，打開種子袋置于體式鏡下，隨機挑選5個視野，分別計算每個視野的種子總數、死亡種子總數和萌發種子總數，并計算萌發率、死亡率和萌發生長指數。萌發率=（萌發種子總數/統計種子總數）×100%；死亡率=（死亡種子總數/統計種子總數）×100%；萌發生長指數=（N1+2N2+3N3+4N4）/（N0+N1+N2+N3+N4），其中N0是未萌發種子數，N1、N2、N3、N4是種子萌發階段1、2、3、4的種子數[23]。萌發生長指數能夠反映種子萌發后各階段原球莖的生長情況。運用SPSS 17.0軟件對統計數據進行單因素方差分析，分析各因子對天麻種子自然萌發和生長的影響。

2結果與分析

2.1不同貯藏方式對天麻種子活力的影響

經過TTC染色檢測有效種胚種子的活力，檢測結果（表1）表明，不同貯藏方式對種子活力的影響差異顯著，新鮮種子活力最高，其次是4 ℃冷藏種子，常溫貯藏種子活力最低。常溫貯藏的紅天麻種子與烏天麻種子活力分別降低到55.09%和55.37%，4 ℃冷藏的紅天麻種子和烏天麻種子活力分別降低到70.21%和69.54%，兩種天麻之間差異不顯著。

2.2天麻種子自然萌發過程

紅天麻、烏天麻兩種天麻種子在自然條件下，種子萌發率低、死亡率高，不同貯藏方式的兩種天麻種子經歷了相同的變化過程：種胚正常、種胚變色（黑色、紅褐色）、種胚消解，變色種胚的種子失去了活力不能正常萌發，并最終消解。兩種天麻種子吸收水分都發育至種胚膨大階段，隨后大部分種子停止生長；少部分種子萌發生長（圖1）。根據天麻種子萌發過程中形態大小及結構分化情況將天麻種子萌發生長發育過程劃分為5個階段[24，25]。天麻種子萌發的5個階段為種胚未變化（階段0）、種胚膨大而尚未突破種皮（階段1）、種胚膨大突破種皮（階段2）、種胚出現分生原基（階段3）、芽體形成（階段4），其中階段0的種子未萌發，階段1、2、3、4為種子已萌發。

2.3不同貯藏方式對天麻種子死亡率的影響

由表2可知，3種不同貯藏方式的兩種天麻種子在8～12月死亡率都呈上升趨勢，8月種子死亡率最低，12月種子死亡率最高。紅天麻種子在4 ℃冷藏和常溫貯藏下其各月死亡率差異均達到顯著水平，新鮮種子各月死亡率均較低；烏天麻新鮮種子各月死亡率差異均達到顯著水平，常溫貯藏種子死亡率除9月和10月間差異不顯著外，其他月份間差異也均達到顯著水平。此外，3種不同貯藏方式的兩種天麻種子的死亡率在各月都是常溫貯藏種子死亡率顯著高于4 ℃冷藏種子和新鮮種子，4 ℃冷藏種子顯著高于新鮮種子。相同貯藏方式下的兩種天麻種子，除10月的常溫貯藏種子外，其他各貯藏方式下的烏天麻種子各月死亡率均高于紅天麻。

2.4不同貯藏方式對天麻種子萌發率的影響

由表3可知，3種不同貯藏方式的兩種天麻種子在8～12月的萌發率總體呈下降趨勢，8月種子萌發率最高，12月種子萌發率最低。紅天麻種子在常溫貯藏條件下除10月和11月間種子萌發率差異不顯著外，其他月份間差異顯著，4 ℃冷藏種子和新鮮種子的萌發率各月間差異均達到顯著水平；3種不同貯藏方式的烏天麻種子在各月間的差異均達到顯著水平。此外，除紅天麻8月和11月4 ℃冷藏種子和新鮮種子差異不顯著外，其他月份兩種天麻均是4 ℃冷藏種子萌發率顯著高于新鮮種子，新鮮種子各月的萌發率顯著高于常溫貯藏種子。

2.5不同貯藏方式對天麻種子萌發生長指數的影響

由表4可知，不同貯藏方式的兩種天麻種子在8～12月的萌發生長指數變化趨勢一致，均呈先上升后下降的變化趨勢，9月萌發生長指數達到最高。此外，在相同貯藏條件下的兩種天麻種子，除8月和9月的4 ℃冷藏種子外，烏天麻種子各月萌發生長指數均高于紅天麻。兩種紅天麻種子各貯藏方式間差異也均達顯著水平。

3結論與討論

3.1結論

天麻種子6月播種后，8月萌發率最高，9月萌發生長指數最高，12月死亡率最高；4 ℃冷藏有利于提高種子的萌發率。因此在6月選擇新鮮種子或短時間冷藏種子播種有利于種子的萌發，在9月利于采樣，可以獲得理想的萌發菌分離材料。

3.2討論

1）天麻種子在6月播種，8月萌發率高、死亡率低，9月種子萌發生長指數較高。這主要因為每年的5～7月是雨季，天麻原生地此時的空氣濕度在85%左右，土壤濕度在90%以上，這為種子的萌發提供了充足的水分；此時，天麻原生地平均氣溫在18～25 ℃之間，是種子最適萌發溫度；此時的溫濕度也是萌發菌最適合生長的條件[26]，所以此時的萌發菌能侵染充分吸水膨大的天麻種子與其形成共生體系，為其提供養分，從而促進種子的萌發和生長。

2）環境溫度和濕度是影響種子保存后種子活力的主要外因。在常溫常濕環境下種子劣變較快，主要是因為在常溫常濕條件下，種子種皮透性加大，種子體內出現了大量的羥自由基及其衍生物和超氧陰離子，這些物質的積累最終導致種子劣變和衰老速度加快[27]。本研究得出，天麻種子在常溫下貯藏其種子活力降低，這一結論與上述研究結果一致，是因為天麻等蘭科植物種子在常溫下種子種皮通透性加大。有研究者用超低溫和超干燥對蘭科植物種子保存做了研究，超低溫和超干燥都是為了抑制種子體內酶活反應，從而保證種子活力[28，29]。因此，在常溫下我們可以嘗試用干燥法處理天麻種子，既防止種子霉變又抑制種子體內酶活反應，從而保證種子活力。

3）幼嫩的原球莖在天麻生命整個過程中是最薄弱的環節，大量的個體會在早期因養分不足及外界環境因素的影響，如溫度、濕度、病蟲害等夭亡[26]。本研究發現，天麻種子死亡大多是在早期原球莖階段；此階段的原球莖種皮透性加大、種胚新陳代謝活躍，因沒有及時地與萌發真菌接觸形成共生獲得養分而饑餓，加上外界環境不利因素的影響導致原球莖抵抗環境能力弱而死亡。因此，在選擇播種樣地時，有針對性地選擇有野生天麻生長、生境通風性好、落葉腐殖層透水透氣較好的樣地，將有助于降低種子死亡率。

4）蘭科植物種子在自然條件下萌發率很低，影響其萌發的因素有種皮機械阻力和透水透氣性差、種胚發育不完全、營養物質過少以及存在抑制物質[30]。在自然條件下，蘭科植物種子的萌發必須依靠真菌的侵染來完成，但萌發率非常低。天麻種子呈粉末狀，在顯微鏡下觀察，種子呈紡錘形，結構比較簡單，由1層透明的種皮和1個種胚組成，需要真菌侵染為其提供養分才能萌發，因此在自然條件下，天麻種子萌發率很低。相關研究表明，成熟的蘭科植物種子采集后保存在4 ℃黑暗環境中，有助于打破種子的休眠，提高種子的萌發率[13，25，31]。本研究得出，天麻種子在4 ℃冷藏20 d后，種子的萌發率高于新鮮種子，這與上述研究結果一致，是因為天麻等蘭科植物種子在成熟的過程中種子生理和結構發生了變化，在生理上將形成休眠機制，在結構上形成一層不滲透結構[13，25]，因此打破種子休眠機制和不滲透結構，提高種子萌發率是關鍵，選用低溫保存可以打破種子休眠機制，提高種子萌發率。

5）天麻野生資源保護撫育是根據天麻植物生長特性及對生態環境條件的要求，在其原生境或相似的環境中，通過人為的介入增加種群數量，從而保持群落生態平衡的一種方式。本研究得出，天麻種子在6月播種，8月有較低的死亡率和較高的萌發率，9月有較高的萌發生長指數，其生長周期較長，當年可獲得次生原球莖，所以在天麻野生資源保護撫育時，可人為提早升溫讓天麻抽薹開花，在4～5月完成天麻種子播種，這樣天麻就有較長的生長周期，在當年可得到更多的原球莖來分離萌發菌；同樣，在天麻有性繁殖栽培產業中可提前升溫，使天麻的生長周期比天麻正常抽薹開花種植多1～2個月，從而提高當年的天麻產量。

本研究未對室內溫度和濕度進行測定，也沒有定期對保存種子進行活力檢測，所以本次試驗結果不能說明天麻種子在自然狀態下種子活力變化規律，也不能說明天麻種子在自然條件下或生產上可允許保存的最長時間，所以用什么樣的條件保存天麻種子既能保證其種子活力，又能提高天麻種子萌發率，是值得研究的。

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