丁鱥疑似致病真菌的分離鑒定與生物學特性

丁鱥疑似致病真菌的分離鑒定與生物學特性

摘要：從患病丁鱥（Timca tinca L.）體表上分離出6株疑似致病真菌，選擇3株真菌分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，并根據形態學特征及分子生物學方法對其進行了鑒定。結果表明，菌株1為墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）、菌株2為產黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）、菌株3為卷枝毛霉（Mucor circinelloides Van Tiegh）；進一步對其進行生物學特性的初步研究，確定了其最適生長溫度為25～30 ℃，最適pH為中性偏酸性。

關鍵詞：丁鱥（Timca tinca L.）；真菌；分離鑒定；生物學特性

中圖分類號：S965.199；Q949.32文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2376-03

Isolation，Identification and Biological Characteristics of

Suspicious Pathomycete from Timca tinca L.

YANG Xiu-rong

（Life Sciences Institute， Zunyi Normal College/Key Laboratory of Regional Characteristic for Conservation

and Utilization of Plant Resource in Chishui River Basin，Zunyi 563002，Guizhou，China）

Abstract：Six strains of fungi were isolated from sick Timca tinca L. Three strains screened out from them were named as strain one，strain two and strain three and identified by morphological feature and molecular biology. The results showed that strain one was P. atramentosum Thom. Strain two was P.chrysogenum Thom. Strain three was M.circinelloides Van Tiegh. The optimal temperature was 25～30 ℃ and optimal pH was meutral or partial acidity.

Key words：Timca tinca L.； fungus； isolation and identification； biological characteristics

基金項目：貴州省遵義市科技局項目[遵市科合社字（2009）26號]

丁鱥（Timca tinca L.）隸屬魚綱鯉形目鯉科雅羅魚亞科丁鱥屬，在我國僅產于新疆阿勒泰地區的額爾齊斯河和烏倫古河水系，是當地的主要經濟魚類之一[1]。丁鱥的血小板、紅細胞和白細胞均遠高于本地鯉魚（Cyprinus carpio）、鯽魚（Carassius auratus），有利于增強抗病力，且可作為補充鉀、鎂和磷的營養食物，其經濟價值在鱖魚（Siniperca chuatsi）之上，而生產成本與鯉魚相當[2]。由于丁鱥肉嫩味鮮，經濟效益較高，丁鱥成為烏江網箱養殖的一種重要魚類。隨著現代化工業的發展和人口的不斷增加，大量的工業、農業和生活污水源源不斷地流入烏江，使養殖水體污染越來越嚴重，已給丁鱥養殖造成了巨大的經濟損失。真菌性疾病是困擾丁鱥養殖較嚴重的病害之一，故對患病丁鱥個體進行真菌的分離與鑒定，可為真菌性疾病的防治提供理論依據，具有重要的意義。

傳統的真菌分類方法主要根據真菌菌株的形態特征、生長特性及生理生化指標來進行，包括形態學分類、生理學及生態學特征分類、血清學分類和真菌的菌體組成分析分類等[3，4]。真菌的形態特征復雜，并且部分生理生化指標和形態特征會隨著環境的變化而不穩定，從而導致鑒定費時、費力且不準確。隨著現代生物技術的發展，尤其是分子生物學和生物信息學等相關學科的迅速發展，一系列分子生物學方法逐漸被應用到真菌的分類鑒定中，其中rDNA序列分析和RFLP分析是目前真菌分類鑒定中常用的方法[5]。將傳統真菌分類方法與分子鑒定相結合，可以使真菌分類鑒定更加快速、穩定、可靠。

本研究以患病丁鱥為材料，采用rRNA序列分析與傳統真菌分類法相結合進行鑒定，對分離所得菌株采取先擴增其18S rRNA基因測定其序列，通過同源性比對確定該菌株所在的屬，再根據其形態特征和顯微結構鑒定到種，并初步研究了不同溫度和pH條件下丁鱥的生長狀況，為其疾病預防提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

患病丁鱥取自烏江偏巖河某網箱養殖場。

1.2菌株的分離和培養

選取體表有真菌侵害癥狀的患病丁鱥，用無菌水清洗后，剖取丁鱥體表損傷部位、肝臟、消化道等組織，用接種環接種到PDA培養基上。25 ℃培養，待其長出菌落后挑取菌落轉接種至另一PDA培養基上，直至生長單菌落。

1.3菌株的分子鑒定

1.3.1 真菌DNA的提取 將篩選出的真菌分別接種在PDA培養基上，25 ℃培養3 d，從培養基上挑取新鮮菌絲放置于研磨鍋中，加入700 μL 2%的 CTAB溶液，用滅菌石英砂研磨菌絲體，然后轉移至2 mL EP管中。在恒溫水浴鍋上于65 ℃下作用30 min（每10 min振蕩一次），然后加等體積氯仿和異戊醇混合液（24∶1）輕輕充分搖勻，然后4 ℃、12 000r/min離心10 min。取上清液至新EP管中，加等體積異丙醇在常溫下靜置30 min，而后4 ℃、12 000 r/min離心10 min。將上清液移至新EP管中，加2倍體積75%的乙醇沉淀DNA，而后4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液后室溫晾干，以50 μL TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存備用。

1.3.2菌株18S rRNA基因的PCR鑒定PCR擴增鑒定以通用引物為NS1與NS6[6]，引物序列為：NS1（5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′），NS6（5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC

-3′）。PCR 擴增體系為：10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTPs 4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，模板DNA 2.0 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退化50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果進行BLAST比對。

1.4菌株的形態學鑒定

將真菌接種到PDA培養基上，25 ℃恒溫培養3～12 d，觀察菌落形態與顏色，并在顯微鏡下觀察其產孢結構、分生孢子梗著生情況、孢子的形態、大小與顏色等。

1.5菌株的生物學特性初步研究

1.5.1不同溫度下菌株的生長狀況將真菌接種在PDA培養基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2不同pH下菌株的生長狀況將真菌接種在不同pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養基上， 25 ℃培養3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結果與分析

2.1致病真菌的分離結果

從患病丁鱥上共分離出6株疑似致病真菌，根據菌落形態及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。

2.218S rRNA基因的PCR擴增結果

3個菌株18S rRNA基因的PCR擴增結果見圖1，3個菌株均擴增出約1 500 bp的DNA片段，將3個菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中，PCR擴增結果見表1。

2.3菌株的形態觀察

2.3.1菌株1的形態特征在PDA培養基上培養 3～12 d，萌發時菌絲呈白色，5 d后菌落絨狀，中間呈灰綠色或暗綠色，邊緣白色，背面淡黃色（圖2a）。在CA培養基上，菌絲體白色；菌落絨狀，黃褐色，背面呈淡褐色（圖2b）。孢梗莖光滑，無膨大，帚狀枝三輪生；副枝叉開，光滑；分生孢子光滑，橢圓形，綠色（圖2c、圖2d）。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株1初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）[7]。

2.3.2菌株2的形態特征在PDA培養基上培養 3～12 d，菌絲白色，菌落藍綠色，絨狀，邊緣絲狀（圖3a），背面淡黃色，有大量淡黃色滲出液。帚狀枝三輪生，彼此之間呈現不同程度地叉開，分生孢子呈球形或近球形，壁平滑（圖3b）。在CA培養基上，菌落質地絮狀或絨狀，淡黃色至淺褐色，邊緣白色，分生孢子面灰綠色，中間較老部分呈橘褐色，背面呈不同程度的黃色或橙色。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株2初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）產黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）[7]。

2.3.3菌株3的形態特征在PDA培養基上培養3～12 d，菌絲萌發時白色，后變為灰褐色（圖4a）。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，單軸分枝；孢子囊大，球形，含孢子甚多，頂生；孢囊孢子卵圓形，壁薄，平滑（圖4b）。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株3初步鑒定為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）毛霉屬（Mucor Micheli Ex Fries）卷枝毛霉（M. circinelloides Van Tiegh）[8]。

2.4菌株的生物學特性

2.4.1不同溫度對3個菌株生長速率的影響3個菌株在不同溫度下的生長情況見表2。由表2可以看出，在不同溫度條件下，不同真菌的生長速率是不同的。3個菌株在5 ℃時均基本不萌發，在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25～30 ℃是這3個菌株生長的較適溫度。

2.4.2不同pH對3個菌株生長速率的影響3個菌株在不同pH的培養基上生長情況見表3。由表3可以看出，在不同pH的培養基上，不同真菌的生長速率是不同的。3個菌株在pH 4～11均能生長，菌株1在pH為7時生長最快，菌株2和菌株3在pH為6時生長最快，pH的降低和升高均會使這3種真菌的生長速度下降。總體來說，這3個菌株生長的較適pH是中性偏酸性。

3小結與討論

從患病丁鱥中共分離出6株疑似致病真菌，根據菌落形態及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，進一步確定菌株1為墨綠青霉，菌株2為產黃青霉，菌株3為卷枝毛霉。3株菌株的較適生長溫度為25～30 ℃，較適pH為中性偏酸性。由于真菌的種類多、形態特征復雜，并且少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，可能造成鑒定結果有一定偏差[9]，增加了鑒定難度，本研究中將傳統真菌分類方法與分子鑒定相結合，使真菌分類鑒定更加快速、穩定、可靠。

參考文獻：

[1] 陳淑萍，康萌.水產養殖新品種——丁鱥[J].黑龍江水產， 2002（6）：1-2.

[2] 譚清朗.高檔經濟魚歐洲丁鱥極其養殖技術[J].農村百事通，2006（1）：45.

[3] 邵力乎.真菌分類學[M].北京：中國林業出版社，1984.

[4] 中國科學院微生物研究所.常見及常用真菌[M].北京：科學出版社，1978.250-274.

[5] 蔣盛巖，張志光.真菌的分子生物學鑒定方法研究進展[J].生物學通報，2002，37（10）：4-6.

[6] 周小玲，沈微，饒志明，等.一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J].微生物學通報，2004，31（4）：89-92.

[7] 孔華忠.中國真菌志（第35卷）[M].北京：科學出版社，2003. 139-144.

[8] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.70-71.

[9] 林劍偉，林劍偉，闕友雄，等.核糖體DNA 的內轉錄間隔區序列標記在真菌分類鑒定中的應用[J].生物技術通訊，2007，18（2）：292-294.

1.3.2菌株18S rRNA基因的PCR鑒定PCR擴增鑒定以通用引物為NS1與NS6[6]，引物序列為：NS1（5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′），NS6（5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC

-3′）。PCR 擴增體系為：10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTPs 4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，模板DNA 2.0 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退化50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果進行BLAST比對。

1.4菌株的形態學鑒定

將真菌接種到PDA培養基上，25 ℃恒溫培養3～12 d，觀察菌落形態與顏色，并在顯微鏡下觀察其產孢結構、分生孢子梗著生情況、孢子的形態、大小與顏色等。

1.5菌株的生物學特性初步研究

1.5.1不同溫度下菌株的生長狀況將真菌接種在PDA培養基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2不同pH下菌株的生長狀況將真菌接種在不同pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養基上， 25 ℃培養3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結果與分析

2.1致病真菌的分離結果

從患病丁鱥上共分離出6株疑似致病真菌，根據菌落形態及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。

2.218S rRNA基因的PCR擴增結果

3個菌株18S rRNA基因的PCR擴增結果見圖1，3個菌株均擴增出約1 500 bp的DNA片段，將3個菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中，PCR擴增結果見表1。

2.3菌株的形態觀察

2.3.1菌株1的形態特征在PDA培養基上培養 3～12 d，萌發時菌絲呈白色，5 d后菌落絨狀，中間呈灰綠色或暗綠色，邊緣白色，背面淡黃色（圖2a）。在CA培養基上，菌絲體白色；菌落絨狀，黃褐色，背面呈淡褐色（圖2b）。孢梗莖光滑，無膨大，帚狀枝三輪生；副枝叉開，光滑；分生孢子光滑，橢圓形，綠色（圖2c、圖2d）。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株1初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）[7]。

2.3.2菌株2的形態特征在PDA培養基上培養 3～12 d，菌絲白色，菌落藍綠色，絨狀，邊緣絲狀（圖3a），背面淡黃色，有大量淡黃色滲出液。帚狀枝三輪生，彼此之間呈現不同程度地叉開，分生孢子呈球形或近球形，壁平滑（圖3b）。在CA培養基上，菌落質地絮狀或絨狀，淡黃色至淺褐色，邊緣白色，分生孢子面灰綠色，中間較老部分呈橘褐色，背面呈不同程度的黃色或橙色。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株2初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）產黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）[7]。

2.3.3菌株3的形態特征在PDA培養基上培養3～12 d，菌絲萌發時白色，后變為灰褐色（圖4a）。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，單軸分枝；孢子囊大，球形，含孢子甚多，頂生；孢囊孢子卵圓形，壁薄，平滑（圖4b）。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株3初步鑒定為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）毛霉屬（Mucor Micheli Ex Fries）卷枝毛霉（M. circinelloides Van Tiegh）[8]。

2.4菌株的生物學特性

2.4.1不同溫度對3個菌株生長速率的影響3個菌株在不同溫度下的生長情況見表2。由表2可以看出，在不同溫度條件下，不同真菌的生長速率是不同的。3個菌株在5 ℃時均基本不萌發，在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25～30 ℃是這3個菌株生長的較適溫度。

2.4.2不同pH對3個菌株生長速率的影響3個菌株在不同pH的培養基上生長情況見表3。由表3可以看出，在不同pH的培養基上，不同真菌的生長速率是不同的。3個菌株在pH 4～11均能生長，菌株1在pH為7時生長最快，菌株2和菌株3在pH為6時生長最快，pH的降低和升高均會使這3種真菌的生長速度下降。總體來說，這3個菌株生長的較適pH是中性偏酸性。

3小結與討論

從患病丁鱥中共分離出6株疑似致病真菌，根據菌落形態及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，進一步確定菌株1為墨綠青霉，菌株2為產黃青霉，菌株3為卷枝毛霉。3株菌株的較適生長溫度為25～30 ℃，較適pH為中性偏酸性。由于真菌的種類多、形態特征復雜，并且少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，可能造成鑒定結果有一定偏差[9]，增加了鑒定難度，本研究中將傳統真菌分類方法與分子鑒定相結合，使真菌分類鑒定更加快速、穩定、可靠。

參考文獻：

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[2] 譚清朗.高檔經濟魚歐洲丁鱥極其養殖技術[J].農村百事通，2006（1）：45.

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[5] 蔣盛巖，張志光.真菌的分子生物學鑒定方法研究進展[J].生物學通報，2002，37（10）：4-6.

[6] 周小玲，沈微，饒志明，等.一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J].微生物學通報，2004，31（4）：89-92.

[7] 孔華忠.中國真菌志（第35卷）[M].北京：科學出版社，2003. 139-144.

[8] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.70-71.

[9] 林劍偉，林劍偉，闕友雄，等.核糖體DNA 的內轉錄間隔區序列標記在真菌分類鑒定中的應用[J].生物技術通訊，2007，18（2）：292-294.

1.3.2菌株18S rRNA基因的PCR鑒定PCR擴增鑒定以通用引物為NS1與NS6[6]，引物序列為：NS1（5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′），NS6（5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC

-3′）。PCR 擴增體系為：10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTPs 4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，模板DNA 2.0 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退化50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果進行BLAST比對。

1.4菌株的形態學鑒定

將真菌接種到PDA培養基上，25 ℃恒溫培養3～12 d，觀察菌落形態與顏色，并在顯微鏡下觀察其產孢結構、分生孢子梗著生情況、孢子的形態、大小與顏色等。

1.5菌株的生物學特性初步研究

1.5.1不同溫度下菌株的生長狀況將真菌接種在PDA培養基上，在不同溫度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培養3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

1.5.2不同pH下菌株的生長狀況將真菌接種在不同pH（4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養基上， 25 ℃培養3～12 d，觀察菌株的生長狀況。

2結果與分析

2.1致病真菌的分離結果

從患病丁鱥上共分離出6株疑似致病真菌，根據菌落形態及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3。

2.218S rRNA基因的PCR擴增結果

3個菌株18S rRNA基因的PCR擴增結果見圖1，3個菌株均擴增出約1 500 bp的DNA片段，將3個菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中，PCR擴增結果見表1。

2.3菌株的形態觀察

2.3.1菌株1的形態特征在PDA培養基上培養 3～12 d，萌發時菌絲呈白色，5 d后菌落絨狀，中間呈灰綠色或暗綠色，邊緣白色，背面淡黃色（圖2a）。在CA培養基上，菌絲體白色；菌落絨狀，黃褐色，背面呈淡褐色（圖2b）。孢梗莖光滑，無膨大，帚狀枝三輪生；副枝叉開，光滑；分生孢子光滑，橢圓形，綠色（圖2c、圖2d）。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株1初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）墨綠青霉（Penicillium atramentosum Thom）[7]。

2.3.2菌株2的形態特征在PDA培養基上培養 3～12 d，菌絲白色，菌落藍綠色，絨狀，邊緣絲狀（圖3a），背面淡黃色，有大量淡黃色滲出液。帚狀枝三輪生，彼此之間呈現不同程度地叉開，分生孢子呈球形或近球形，壁平滑（圖3b）。在CA培養基上，菌落質地絮狀或絨狀，淡黃色至淺褐色，邊緣白色，分生孢子面灰綠色，中間較老部分呈橘褐色，背面呈不同程度的黃色或橙色。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株2初步鑒定為絲孢菌目（Hyphomycetales）叢梗孢科（Moniliaceae）青霉屬（Penicillium）產黃青霉（Penicillium chrysogenum Thom）[7]。

2.3.3菌株3的形態特征在PDA培養基上培養3～12 d，菌絲萌發時白色，后變為灰褐色（圖4a）。菌絲生長迅速，無假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成層，直立，菌絲全部頂生孢子囊，褐色，孢子囊梗長，單軸分枝；孢子囊大，球形，含孢子甚多，頂生；孢囊孢子卵圓形，壁薄，平滑（圖4b）。

綜合形態特征和分子鑒定結果，菌株3初步鑒定為毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）毛霉屬（Mucor Micheli Ex Fries）卷枝毛霉（M. circinelloides Van Tiegh）[8]。

2.4菌株的生物學特性

2.4.1不同溫度對3個菌株生長速率的影響3個菌株在不同溫度下的生長情況見表2。由表2可以看出，在不同溫度條件下，不同真菌的生長速率是不同的。3個菌株在5 ℃時均基本不萌發，在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，真菌生長速率加快，25～30 ℃是這3個菌株生長的較適溫度。

2.4.2不同pH對3個菌株生長速率的影響3個菌株在不同pH的培養基上生長情況見表3。由表3可以看出，在不同pH的培養基上，不同真菌的生長速率是不同的。3個菌株在pH 4～11均能生長，菌株1在pH為7時生長最快，菌株2和菌株3在pH為6時生長最快，pH的降低和升高均會使這3種真菌的生長速度下降。總體來說，這3個菌株生長的較適pH是中性偏酸性。

3小結與討論

從患病丁鱥中共分離出6株疑似致病真菌，根據菌落形態及顏色選擇3株，分別編號為菌株1、菌株2、菌株3，進一步確定菌株1為墨綠青霉，菌株2為產黃青霉，菌株3為卷枝毛霉。3株菌株的較適生長溫度為25～30 ℃，較適pH為中性偏酸性。由于真菌的種類多、形態特征復雜，并且少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，可能造成鑒定結果有一定偏差[9]，增加了鑒定難度，本研究中將傳統真菌分類方法與分子鑒定相結合，使真菌分類鑒定更加快速、穩定、可靠。

參考文獻：

[1] 陳淑萍，康萌.水產養殖新品種——丁鱥[J].黑龍江水產， 2002（6）：1-2.

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[6] 周小玲，沈微，饒志明，等.一種快速提取真菌染色體DNA的方法[J].微生物學通報，2004，31（4）：89-92.

[7] 孔華忠.中國真菌志（第35卷）[M].北京：科學出版社，2003. 139-144.

[8] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.70-71.

[9] 林劍偉，林劍偉，闕友雄，等.核糖體DNA 的內轉錄間隔區序列標記在真菌分類鑒定中的應用[J].生物技術通訊，2007，18（2）：292-294.