酶法破壁轉(zhuǎn)化廢菌體制備甲殼低聚糖

江得源+呂夢圓+石佳仙+蔡俊+胡瑛

摘要：試驗(yàn)采用酶法轉(zhuǎn)化檸檬酸發(fā)酵后的廢菌體，研究了酶法破壁及降解細(xì)胞壁幾丁質(zhì)制備甲殼低聚糖的工藝條件。采用紅外光譜法對(duì)破壁后產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，采用乙酰丙酮法測定幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)物中乙酰氨基葡萄糖還原糖的含量。結(jié)果表明，破壁產(chǎn)物的主要成分是（1-3）-a-D-葡聚糖和幾丁質(zhì)的復(fù)合物，10 mg廢菌絲體破壁產(chǎn)物中加入0.3%幾丁質(zhì)酶降解反應(yīng)7 d后可得到0.23 mg乙酰氨基葡萄糖還原糖。該方法制備甲殼低聚糖條件溫和、工藝簡便，為發(fā)酵廢渣的綜合利用開辟了新途徑。

關(guān)鍵詞：廢菌體；酶法；破壁；降解；甲殼低聚糖

中圖分類號(hào)：TS245.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2014）10-2404-04

Enzymatic Conversion of Chitooligosaccharides from Waste Mycelia

in Citric Acid Plant

JIANG De-yuan，L？譈 Meng-yuan，SHI Jia-xian，CAI Jun，HU Ying

（College of Bioengineering， Faculty of Light Industry， Hubei Univeristy of Technology/Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Wuhan 430068，China）

Abstract： Waste mycelia from citric acid production plant were used to produce chitooligosaccharides by enzymatic cell wall breaking and enzymatic degradation. The process conditions of the cell wall breaking and degradation by enzymes were investigated. FT-IR spectra were used to characterize the chemical structure of the product from the cell wall breaking. Acetylacetones method was used to determine the content of N-acetyl-glucosamine reducing sugar. The results showed that the product from the cell wall breaking was the complex polysaccharide with （1-3）-a-D-glucan and chitin. Degradation by 0.3% chitinase with 10 mg products from the cell wall breaking for 7 d， 0.23 mg of N-acetyl-glucosamine reducing sugar was obtained. This new method is devised to obtain N-acetyl-glucosamine and disaccharides with stable properties and many important biological activities and functions by mild reaction and less environmental pollution. A new way for the comprehensive utilization of fermented waste is developed.

Key words：mycelia； enzymatic preparation； cell wall breaking； degradation； Chitooligosacchides

基金項(xiàng)目：湖北工業(yè)大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（BSQD0813）；2012年全國大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210500030）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201425）

發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)抗生素、有機(jī)酸后產(chǎn)生大量廢菌絲體，作為發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境造成了極大的污染，但作為一種可再生資源，綜合利用具有重要意義。黑曲霉是發(fā)酵工業(yè)最常用的真菌，也是含有幾丁質(zhì)最多的真菌，其產(chǎn)量十分驚人，我國檸檬酸產(chǎn)量達(dá)50萬t，產(chǎn)黑曲霉干菌體超過8萬t，可從中提取到約1.6萬t的幾丁質(zhì)，因此利用檸檬酸工廠廢菌體提取幾丁質(zhì)、殼聚糖或者甲殼低聚糖具有非常廣闊的應(yīng)用前景[1]。

目前國內(nèi)利用檸檬酸廠廢菌體提取幾丁質(zhì)和殼聚糖大多采用酸堿法[2，3]，工藝簡單、操作方便，但污染環(huán)境且樣品純度及得率都較低。而采用生物法可大大減少環(huán)境污染，同時(shí)顯著提高產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)率，因此采用生物法利用檸檬酸工廠廢菌體提取或制備甲殼素及其低聚糖有很好的應(yīng)用前景。有研究者采用生物法利用檸檬酸發(fā)酵工廠廢菌體制備殼聚糖，避免了酸堿法給環(huán)境帶來的污染，分別選擇蝸牛酶和溶菌酶、中性蛋白酶和幾丁質(zhì)脫乙酰酶來破碎細(xì)胞、脫蛋白及脫乙酰基，使黑曲霉細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖。但真菌細(xì)胞壁的主要成分是（1-3）-β-D-葡聚糖和一些（1-6）-β-D-葡聚糖連接的長鏈，幾丁質(zhì)鏈還原端的N-乙酰氨基葡萄糖通過（1-4）-或（1-2）-連接到側(cè)鏈的葡萄糖單元上[4]。所以，很難得到純凈的幾丁質(zhì)。采用專一性強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶直接降解細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)得到甲殼低聚糖，避免使用多種酶的反應(yīng)，降低成本，且可直接得到甲殼低聚糖，但目前采用生物法以廢菌體來制備甲殼低聚糖尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。和大分子相比，甲殼低聚糖無毒、易被人體吸收，并具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗菌、降膽固醇、保濕及促進(jìn)植物抗逆生長等多種生理功能，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[5，6]。

試驗(yàn)利用檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的黑曲霉廢菌體，通過酶法破壁和降解等步驟制備甲殼低聚糖或單糖（本試驗(yàn)以乙酰氨基葡萄糖還原糖為代表），探討其反應(yīng)條件，并用紅外光譜對(duì)破壁后產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，采用鐵氰化鉀法和乙酰丙酮法測定幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)物中乙酰氨基葡萄糖還原糖（NAG）的含量，確立最佳反應(yīng)條件。該法制備甲殼低聚糖條件溫和，綜合利用工廠廢菌體，減少環(huán)境污染，變廢為寶，降低原料成本，同時(shí)為再生資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

檸檬酸廠發(fā)酵廢菌體由黃石市興華生化有限公司提供，破壁所用的蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶購于武漢華順生物技術(shù)有限公司，幾丁質(zhì)酶由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1去雜粉碎過40目篩去除廢菌體中雜質(zhì)，并經(jīng)過反復(fù)洗滌至中性，真空干燥或冷凍干燥后，由氣流式超細(xì)粉碎儀進(jìn)行粉碎至白色粉末狀，保存于干燥器中。

1.2.2酶法破壁

1）破壁方法。稱取0.75 g廢菌體干樣，加入30 mL 0.02 mol/L HOAc-NaOAc緩沖溶液（pH 5.6），加入1%的酶，磁力攪拌下，在50 ℃溫水浴中反應(yīng)5 h后，取出煮沸10～15 min滅酶，8 000 r/min下離心20 min，取上清液采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量，并以此考察破壁效果，并以牛血清白蛋白作標(biāo)樣，做3份平行。

2）酶的選擇。在0.02 mol/L HOAc-NaOAc緩沖溶液（pH 5.0）中分別加入1%的蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶，50 ℃條件下反應(yīng)5 h后滅酶，取上清液測蛋白質(zhì)含量。

3）破壁反應(yīng)條件。①酶量。分別加入2%、4%、6%、8%的蝸牛酶，50 ℃反應(yīng)5 h后滅酶，離心取上清液測蛋白質(zhì)含量。②反應(yīng)pH。分別加入30 mL pH 4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8的 0.02 mol/L HOAc-NaOAc緩沖溶液，加入4%蝸牛酶，50 ℃反應(yīng)5 h后滅酶，離心取上清液測蛋白質(zhì)含量。③反應(yīng)時(shí)間。在50 ℃下分別反應(yīng)0.5、1、2、3、4、5、6、8 h后滅酶，離心取上清液測蛋白質(zhì)含量。

1.2.3酶法與超聲法結(jié)合破壁蝸牛酶50 ℃反應(yīng)5 h前后，采用超聲波破壁，功率400 W，工作時(shí)間15 min，間隔6 s。滅酶離心取上清液測蛋白質(zhì)含量，以單獨(dú)采用蝸牛酶或超聲法破壁的樣品為對(duì)照。

1.2.4傅里葉紅外吸收光譜分析（FT-IR） 取上述離心后的沉淀物冷凍干燥后為破壁產(chǎn)物，研成粉末，樣品真空干燥，KBr壓片，采用Nicolet AVA2TAR360 FTIR光譜儀掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.2.5廢菌絲體中幾丁質(zhì)的降解

1）幾丁質(zhì)酶降解。取破壁后產(chǎn)物0.10 g，加入HOAc-NaOAc緩沖溶液（pH 6.0）10 mL，加入10 mg/mL的牛血清白蛋白30 μL，再加入0.1 mg幾丁質(zhì)酶，37 ℃反應(yīng)6 h，煮沸滅酶，離心取上清液，采用乙酰丙酮法測定降解產(chǎn)物中乙酰氨基葡萄糖還原糖含量[7]。

2）幾丁質(zhì)酶降解條件。①酶量。分別加入0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的幾丁質(zhì)酶，37 ℃反應(yīng)6 h后滅酶，離心取上清液測定乙酰氨基葡萄糖還原糖含量。②反應(yīng)溫度。加入HOAc-NaOAc緩沖溶液（pH 6.0）10 mL，10 mg/mL的牛血清白蛋白30 μL、0.3%幾丁質(zhì)酶，分別在27、32、37、42、47、52、57 ℃下反應(yīng)6 h后滅酶，離心取上清液測定乙酰氨基葡萄糖還原糖含量。③反應(yīng)pH。在10 mL不同pH的HOAc-NaOAc緩沖溶液（pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）中，加入10 mg/mL的牛血清白蛋白 30 μL、0.3%幾丁質(zhì)酶，在37℃下反應(yīng)6 h后滅酶，離心取上清液測定乙酰氨基葡萄糖還原糖含量。④反應(yīng)時(shí)間。在37 ℃下反應(yīng)，每隔24 h取一定量的反應(yīng)液煮沸滅酶，離心取上清液測定乙酰氨基葡萄糖還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1酶法破壁的最佳反應(yīng)條件

2.1.1酶的選擇酶解破壁使廢菌體細(xì)胞破碎，胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來，蛋白質(zhì)也被釋放，可以通過測定釋放出來的蛋白質(zhì)含量來比較破壁效果，從而確定酶解破壁條件。真菌細(xì)胞壁較厚，結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌，其破壁難度較大。由圖1可知，50 ℃反應(yīng)5 h后，蝸牛酶和纖維素酶破壁后上清中蛋白質(zhì)含量較溶壁酶的高，破壁效果較好，蝸牛酶破壁效果最好，纖維素酶次之。蝸牛酶是一種以纖維素酶、半纖維素酶等多種酶混合而成的復(fù)合酶，因此，蝸牛酶對(duì)廢菌體細(xì)胞壁中復(fù)合多糖結(jié)構(gòu)的降解能力較強(qiáng)。

2.1.2酶量不同酶量對(duì)蝸牛酶破壁效果的比較如圖2所示。隨著酶量從2%增加到8%，破壁效果一直呈現(xiàn)明顯升高的趨勢，但升高幅度先大而后較小。兼顧經(jīng)濟(jì)方面的考慮，后面的試驗(yàn)按4%酶量來進(jìn)行。

2.1.3反應(yīng)pH不同pH對(duì)蝸牛酶破壁的結(jié)果如圖3所示，隨著pH的升高，破壁后蛋白質(zhì)含量先升高后降低，在pH 5.6時(shí)為最大，說明蝸牛酶在pH 5.6時(shí)的破壁效果最佳。

2.1.4反應(yīng)時(shí)間不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)蝸牛酶破壁的結(jié)果如圖4所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)含量逐漸升高，到4 h以后蛋白質(zhì)含量趨于平穩(wěn)，增加到8 h變化不大。說明蝸牛酶破壁反應(yīng)5 h后已進(jìn)行得較完全。

2.1.5酶法與超聲法結(jié)合破壁酶法破壁是一種較溫和的破壁方法，因此可將酶法及物理超聲法相結(jié)合，以期達(dá)到最佳破壁效果，結(jié)果（圖5）表明，單獨(dú)酶法破壁明顯比單獨(dú)超聲破壁效果好，而酶法結(jié)合超聲的效果和單獨(dú)酶解的效果較相近，酶+超聲法比超聲+酶法的效果略好，這更加說明酶法反應(yīng)5 h已能較完全地進(jìn)行破壁。

2.2紅外光譜表征

圖6是廢菌體酶法破壁后的產(chǎn)物和商品幾丁質(zhì)的紅外譜圖。比較兩者圖譜可以發(fā)現(xiàn)，1 577、1 561 cm-1處的吸收峰歸屬于-NH2的δ（N-H）及酰胺Ⅱ帶，1 322、1 361 cm-1處吸收峰歸屬于酰胺Ⅲ帶，1 642、1 645 cm-1處的吸收峰歸屬于酰胺Ⅰ帶，所有酰胺帶的出現(xiàn)說明破壁后產(chǎn)物中存在幾丁質(zhì)[8]。而商品幾丁質(zhì)在878 cm-1處有環(huán)伸縮振動(dòng)的吸收峰，顯示出幾丁質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)，而在破壁后的產(chǎn)物中未出現(xiàn)，只在927、845、545 cm-1處顯示出（1-3）-a-D-葡聚糖的特征峰[9，10]，表明廢菌體酶法破壁后的主要產(chǎn)物是以（1-3）-a-D-葡聚糖為主鏈而幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)單元連接在側(cè)鏈上的復(fù)合多糖。

2.3廢菌絲體中幾丁質(zhì)降解的最佳條件

18家族內(nèi)切幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)最終產(chǎn)品為甲殼二糖，采用實(shí)驗(yàn)室自制的幾丁質(zhì)酶降解破壁產(chǎn)物6 h后，乙酰丙酮法則可以測定出還原端為乙酰氨基葡萄糖的低聚糖含量為0.15 mg/mL。幾丁質(zhì)酶降解破壁后的多糖復(fù)合物產(chǎn)生甲殼二糖外，還可能產(chǎn)生還原端為乙酰氨基葡萄糖或其他還原糖的低聚糖。

2.3.1酶量幾丁質(zhì)含量約為菌體干重的20%～22%，因破壁后產(chǎn)物不全部為幾丁質(zhì)，而是幾丁質(zhì)和葡聚糖的復(fù)合物，所以采用不同比例的幾丁質(zhì)酶與破壁產(chǎn)物反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。隨著酶量的升高，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，加入0.3%的幾丁質(zhì)酶得到的NAG含量最高。

2.3.2反應(yīng)溫度在不同溫度下，幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體破壁產(chǎn)物的結(jié)果如圖8所示，可以看出，隨著溫度的升高，產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體所產(chǎn)生的乙酰氨基葡萄糖還原糖含量變化趨勢不明顯，但分別在37 ℃與52 ℃時(shí)出現(xiàn)較高值。

2.3.3反應(yīng)pH不同pH條件下幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體破壁產(chǎn)物的結(jié)果如圖9所示，隨著pH的升高，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量也隨之升高，pH在7～8時(shí)達(dá)到最高值，隨后降低。

2.3.4反應(yīng)時(shí)間不同反應(yīng)時(shí)間幾丁質(zhì)酶與廢菌絲體破壁產(chǎn)物反應(yīng)的結(jié)果如圖10所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量持續(xù)增加，反應(yīng)至7 d后，10 mg廢菌絲體破壁后產(chǎn)物可得到乙酰氨基葡萄糖還原糖的質(zhì)量為0.23 mg，由此可見，該幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性較好，可以用于更長時(shí)間的酶解反應(yīng)來提高產(chǎn)率。

3結(jié)論

從紅外光譜可以看出酶法破壁后得到的廢菌體主要產(chǎn)物是（1-3）-a-D-葡聚糖和幾丁質(zhì)的復(fù)合物，但幾丁質(zhì)酶可以降解該復(fù)合物中的幾丁質(zhì)得到甲殼單糖或低聚糖，10 mg廢菌絲體破壁產(chǎn)物加入0.3%幾丁質(zhì)酶降解7 d后乙酰氨基葡萄糖還原糖的質(zhì)量達(dá)到0.23 mg。該方法條件溫和，可將黑曲霉廢菌體轉(zhuǎn)化為甲殼單糖或低聚糖，不僅變廢為寶，降低原料成本，而且減少環(huán)境污染，為再生資源的綜合利用開辟了新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡俊，杜予民，楊建紅等.酶法提取檸檬酸廢菌體中殼聚糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（12）：39-41，45.

[2] 趙繼倫，王紅林.利用檸檬酸廢菌體制備殼聚糖的工藝研究[J].工業(yè)微生物，1999，29（2）：33-37.

[3] 黃惠莉，林文鑾.黑曲霉菌體制備殼聚糖[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16（4）：575-576，579.

[4] FONTAINE T，SIMENEL C，DUBREUCQ G，et al.Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall[J].The Journal of Biological Chemistry，2000，275（36）：27594-27607.

[5] KONDO Y，NAKATANI A，HAYASHI K，et al. Low molecular weight chitosan prevents the progression of low dose streptozotocin induced slowly progressive diabetes mellitus in mice[J].Biological Pharmacological Bulletin，2000，23（12）：1458-1464.

[6] LEE M，NAH J，KWON Y，et al.Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery [J].Pharmaceutical Research，2001，18（4）： 427-431.

[7] 蘇暢，夏文水，姚慧源.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的測定方法[J].食品工業(yè)科技，2003，24（6）：74-75，77.

[8] 董炎明，許聰義，汪劍煒，等.紅外光譜法測定N-酰化殼聚糖的取代度[J].中國科學(xué)（B輯），2001，31（2）：153-160.

[9] WANG T Q，DENG L，LI S K，et al. Structural characterization of a water-insoluble（1→3）-alpha-D-glucan isolated from the Penicilliu chrysogenum[J]. Carbohydrate Polymers， 2007，67（1）：133-137.

[10] ZHANG P Y， ZHANG L N， CHENG S Y. Chemical structure and molecular weights of ALPHA-（1RAR3）-D-glucan from Lentinula edodes[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 1999，63：1197-1202.

2.3廢菌絲體中幾丁質(zhì)降解的最佳條件

18家族內(nèi)切幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)最終產(chǎn)品為甲殼二糖，采用實(shí)驗(yàn)室自制的幾丁質(zhì)酶降解破壁產(chǎn)物6 h后，乙酰丙酮法則可以測定出還原端為乙酰氨基葡萄糖的低聚糖含量為0.15 mg/mL。幾丁質(zhì)酶降解破壁后的多糖復(fù)合物產(chǎn)生甲殼二糖外，還可能產(chǎn)生還原端為乙酰氨基葡萄糖或其他還原糖的低聚糖。

2.3.1酶量幾丁質(zhì)含量約為菌體干重的20%～22%，因破壁后產(chǎn)物不全部為幾丁質(zhì)，而是幾丁質(zhì)和葡聚糖的復(fù)合物，所以采用不同比例的幾丁質(zhì)酶與破壁產(chǎn)物反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。隨著酶量的升高，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，加入0.3%的幾丁質(zhì)酶得到的NAG含量最高。

2.3.2反應(yīng)溫度在不同溫度下，幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體破壁產(chǎn)物的結(jié)果如圖8所示，可以看出，隨著溫度的升高，產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體所產(chǎn)生的乙酰氨基葡萄糖還原糖含量變化趨勢不明顯，但分別在37 ℃與52 ℃時(shí)出現(xiàn)較高值。

2.3.3反應(yīng)pH不同pH條件下幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體破壁產(chǎn)物的結(jié)果如圖9所示，隨著pH的升高，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量也隨之升高，pH在7～8時(shí)達(dá)到最高值，隨后降低。

2.3.4反應(yīng)時(shí)間不同反應(yīng)時(shí)間幾丁質(zhì)酶與廢菌絲體破壁產(chǎn)物反應(yīng)的結(jié)果如圖10所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量持續(xù)增加，反應(yīng)至7 d后，10 mg廢菌絲體破壁后產(chǎn)物可得到乙酰氨基葡萄糖還原糖的質(zhì)量為0.23 mg，由此可見，該幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性較好，可以用于更長時(shí)間的酶解反應(yīng)來提高產(chǎn)率。

3結(jié)論

從紅外光譜可以看出酶法破壁后得到的廢菌體主要產(chǎn)物是（1-3）-a-D-葡聚糖和幾丁質(zhì)的復(fù)合物，但幾丁質(zhì)酶可以降解該復(fù)合物中的幾丁質(zhì)得到甲殼單糖或低聚糖，10 mg廢菌絲體破壁產(chǎn)物加入0.3%幾丁質(zhì)酶降解7 d后乙酰氨基葡萄糖還原糖的質(zhì)量達(dá)到0.23 mg。該方法條件溫和，可將黑曲霉廢菌體轉(zhuǎn)化為甲殼單糖或低聚糖，不僅變廢為寶，降低原料成本，而且減少環(huán)境污染，為再生資源的綜合利用開辟了新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡俊，杜予民，楊建紅等.酶法提取檸檬酸廢菌體中殼聚糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（12）：39-41，45.

[2] 趙繼倫，王紅林.利用檸檬酸廢菌體制備殼聚糖的工藝研究[J].工業(yè)微生物，1999，29（2）：33-37.

[3] 黃惠莉，林文鑾.黑曲霉菌體制備殼聚糖[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16（4）：575-576，579.

[4] FONTAINE T，SIMENEL C，DUBREUCQ G，et al.Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall[J].The Journal of Biological Chemistry，2000，275（36）：27594-27607.

[5] KONDO Y，NAKATANI A，HAYASHI K，et al. Low molecular weight chitosan prevents the progression of low dose streptozotocin induced slowly progressive diabetes mellitus in mice[J].Biological Pharmacological Bulletin，2000，23（12）：1458-1464.

[6] LEE M，NAH J，KWON Y，et al.Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery [J].Pharmaceutical Research，2001，18（4）： 427-431.

[7] 蘇暢，夏文水，姚慧源.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的測定方法[J].食品工業(yè)科技，2003，24（6）：74-75，77.

[8] 董炎明，許聰義，汪劍煒，等.紅外光譜法測定N-酰化殼聚糖的取代度[J].中國科學(xué)（B輯），2001，31（2）：153-160.

[9] WANG T Q，DENG L，LI S K，et al. Structural characterization of a water-insoluble（1→3）-alpha-D-glucan isolated from the Penicilliu chrysogenum[J]. Carbohydrate Polymers， 2007，67（1）：133-137.

[10] ZHANG P Y， ZHANG L N， CHENG S Y. Chemical structure and molecular weights of ALPHA-（1RAR3）-D-glucan from Lentinula edodes[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 1999，63：1197-1202.

2.3廢菌絲體中幾丁質(zhì)降解的最佳條件

18家族內(nèi)切幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)最終產(chǎn)品為甲殼二糖，采用實(shí)驗(yàn)室自制的幾丁質(zhì)酶降解破壁產(chǎn)物6 h后，乙酰丙酮法則可以測定出還原端為乙酰氨基葡萄糖的低聚糖含量為0.15 mg/mL。幾丁質(zhì)酶降解破壁后的多糖復(fù)合物產(chǎn)生甲殼二糖外，還可能產(chǎn)生還原端為乙酰氨基葡萄糖或其他還原糖的低聚糖。

2.3.1酶量幾丁質(zhì)含量約為菌體干重的20%～22%，因破壁后產(chǎn)物不全部為幾丁質(zhì)，而是幾丁質(zhì)和葡聚糖的復(fù)合物，所以采用不同比例的幾丁質(zhì)酶與破壁產(chǎn)物反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。隨著酶量的升高，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，加入0.3%的幾丁質(zhì)酶得到的NAG含量最高。

2.3.2反應(yīng)溫度在不同溫度下，幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體破壁產(chǎn)物的結(jié)果如圖8所示，可以看出，隨著溫度的升高，產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體所產(chǎn)生的乙酰氨基葡萄糖還原糖含量變化趨勢不明顯，但分別在37 ℃與52 ℃時(shí)出現(xiàn)較高值。

2.3.3反應(yīng)pH不同pH條件下幾丁質(zhì)酶降解廢菌絲體破壁產(chǎn)物的結(jié)果如圖9所示，隨著pH的升高，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量也隨之升高，pH在7～8時(shí)達(dá)到最高值，隨后降低。

2.3.4反應(yīng)時(shí)間不同反應(yīng)時(shí)間幾丁質(zhì)酶與廢菌絲體破壁產(chǎn)物反應(yīng)的結(jié)果如圖10所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，乙酰氨基葡萄糖還原糖含量持續(xù)增加，反應(yīng)至7 d后，10 mg廢菌絲體破壁后產(chǎn)物可得到乙酰氨基葡萄糖還原糖的質(zhì)量為0.23 mg，由此可見，該幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性較好，可以用于更長時(shí)間的酶解反應(yīng)來提高產(chǎn)率。

3結(jié)論

從紅外光譜可以看出酶法破壁后得到的廢菌體主要產(chǎn)物是（1-3）-a-D-葡聚糖和幾丁質(zhì)的復(fù)合物，但幾丁質(zhì)酶可以降解該復(fù)合物中的幾丁質(zhì)得到甲殼單糖或低聚糖，10 mg廢菌絲體破壁產(chǎn)物加入0.3%幾丁質(zhì)酶降解7 d后乙酰氨基葡萄糖還原糖的質(zhì)量達(dá)到0.23 mg。該方法條件溫和，可將黑曲霉廢菌體轉(zhuǎn)化為甲殼單糖或低聚糖，不僅變廢為寶，降低原料成本，而且減少環(huán)境污染，為再生資源的綜合利用開辟了新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡俊，杜予民，楊建紅等.酶法提取檸檬酸廢菌體中殼聚糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（12）：39-41，45.

[2] 趙繼倫，王紅林.利用檸檬酸廢菌體制備殼聚糖的工藝研究[J].工業(yè)微生物，1999，29（2）：33-37.

[3] 黃惠莉，林文鑾.黑曲霉菌體制備殼聚糖[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16（4）：575-576，579.

[4] FONTAINE T，SIMENEL C，DUBREUCQ G，et al.Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall[J].The Journal of Biological Chemistry，2000，275（36）：27594-27607.

[5] KONDO Y，NAKATANI A，HAYASHI K，et al. Low molecular weight chitosan prevents the progression of low dose streptozotocin induced slowly progressive diabetes mellitus in mice[J].Biological Pharmacological Bulletin，2000，23（12）：1458-1464.

[6] LEE M，NAH J，KWON Y，et al.Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery [J].Pharmaceutical Research，2001，18（4）： 427-431.

[7] 蘇暢，夏文水，姚慧源.氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的測定方法[J].食品工業(yè)科技，2003，24（6）：74-75，77.

[8] 董炎明，許聰義，汪劍煒，等.紅外光譜法測定N-酰化殼聚糖的取代度[J].中國科學(xué)（B輯），2001，31（2）：153-160.

[9] WANG T Q，DENG L，LI S K，et al. Structural characterization of a water-insoluble（1→3）-alpha-D-glucan isolated from the Penicilliu chrysogenum[J]. Carbohydrate Polymers， 2007，67（1）：133-137.

[10] ZHANG P Y， ZHANG L N， CHENG S Y. Chemical structure and molecular weights of ALPHA-（1RAR3）-D-glucan from Lentinula edodes[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 1999，63：1197-1202.