流式細胞術(shù)分析尿脫落細胞DNA對膀胱腫瘤的診斷價值研究

胡 旭，劉紅霞

（河南省南陽市中心醫(yī)院檢驗科 473001）

膀胱癌是一種容易復(fù)發(fā)的惡性腫瘤，流行病學(xué)資料顯示其復(fù)發(fā)率可以高達50%～70%，其中30%的患者復(fù)發(fā)后腫瘤的惡性度會顯著增加，可見膀胱癌的早期診斷以及治療后的嚴密隨訪是一項非常重要的工作［1－2］。膀胱鏡、尿脫落細胞涂片檢查以及病理活檢是膀胱癌診斷和隨訪的傳統(tǒng)檢查方法，但尿脫落細胞涂片檢查敏感性低，特別是對于一些低期級腫瘤，不到30%，膀胱鏡和病理活檢雖然是診斷的金標準，但它們屬于有創(chuàng)檢查，對于一些檢查的盲區(qū)（例如膀胱頂部及膀胱前壁的腫瘤）不能觀察和取材［3］。流式細胞術(shù)是一項結(jié)合了多學(xué)科、多領(lǐng)域技術(shù)的檢測方法，已被廣泛的運用于從基礎(chǔ)研究到臨床實踐的各個方面［4］。因此本研究使用流式細胞術(shù)分析尿脫落細胞DNA參數(shù)的改變，探討了其在膀胱腫瘤中的臨床使用意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年10月至2011年4月本院收治的膀胱癌病例68例，其中男44例，女24例，年齡45～74歲，平均（62.7±10.3）歲，所有病例均經(jīng)病理確診。68例患者按WHO三級法分為高分化26例、中分化22例、低分化20例。取同期本院需尿脫落細胞檢查的非膀胱癌患者30例作為對照，其中男20例，女10例，年齡44～76歲，平均（63.2±10.8）歲；慢性前列腺炎12例，尿路結(jié)石10例，腺性膀胱炎8例。兩組在性別、年齡等一般臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 單細胞懸液的制備 采取受試者清晨第2次新鮮中段尿50mL，3 000r／min離心15min棄上清液，取沉淀的細胞磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整細胞濃度為106／L，置冰上待測。

1.3 尿脫落細胞的流式細胞儀檢測 尿脫落細胞使用DNAPrepKit試劑盒（聯(lián)科生物科技有限公司）染色，500μL細胞懸浮液中加入5μL碘化丙啶（PI），避光染色30min，健康人淋巴細胞作為對照經(jīng)相同的處理，前向和側(cè)向散色光設(shè)門去除細胞碎片，F(xiàn)L3通道檢測DNA分布直方圖。S期細胞峰百分比（SPF）＝S期峰道值／（G0／G1＋S＋G2／M）峰道值。膀胱癌的流式細胞術(shù)診斷標準 （出現(xiàn)1個即可）：出現(xiàn)異倍體細胞峰；SPF＞15%，并伴有四倍體細胞峰；G0／G1期的變異率（CV）＞9%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以率表示，使用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組陽性率比較 膀胱癌組和對照組流式細胞儀檢測的陽性率分別為73.5%和26.7%，膀胱癌組的陽性率顯著高于對照組（P＜0.01）。流式細胞儀診斷的敏感性73.5%，特異性86.2%。

2.2 兩組流式細胞儀DNA分布 膀胱癌組異倍體細胞、SPF＞15%和G0／G1期CV＞9%檢出率均顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.3 膀胱癌患者不同分級中DNA分析結(jié)果比較 膀胱癌患者異倍體細胞檢出率在高、中、低分化組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SPF＞15%和G0／G1期CV＞9%檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 兩組流式細胞儀DNA分布［n（%）］

表2 3組流式細胞儀DNA分析結(jié)果的比較［n（%）］

2.4 膀胱癌患者異倍體細胞檢出對患者復(fù)發(fā)的影響 根據(jù)異倍體細胞檢出情況將膀胱癌患者分為異倍體組（42例）和無異倍體組（26例），隨訪2年，統(tǒng)計其治療后的復(fù)發(fā)率，結(jié)果顯示異倍體組復(fù)發(fā)32例（76.2%），無異倍體組復(fù)發(fā)12例（46.2%），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，膀胱癌的高復(fù)發(fā)率使得術(shù)后的隨訪成為膀胱癌治療的一個重要組成部分，膀胱鏡、病理活檢屬侵入性檢查，對患者會造成一定的痛苦和帶來恐懼感，而且容易導(dǎo)致醫(yī)源性尿路感染，故其臨床上的應(yīng)用受到一定的限制［5］。尋找非侵入性、高敏感性的膀胱腫瘤標志物檢測方法，是每一個泌尿外科醫(yī)生所關(guān)心的問題，流式細胞術(shù)可以通過細胞內(nèi)DNA的水平進行細胞周期分析和發(fā)現(xiàn)異常細胞［6－7］，整個細胞周期分為 G0／G1、S、G2／M 期 3 個細胞峰，正常細胞DNA的水平在G0／G1和G2／M期成正態(tài)分布S期成一個加寬的正態(tài)分布，腫瘤細胞處于增殖失控狀態(tài)DNA合成顯著增加就可以在DNA直方圖上表現(xiàn)出來，已有研究顯示流式細胞學(xué)檢查對原位癌的診斷可以高達90.0%，在膀胱癌中可以較膀胱鏡早3～12個月［8］。本研究顯示膀胱癌患者流式細胞儀陽性率顯著高于對照組，其檢出的敏感性為73.5%，特異性為86.2%，說明了尿脫落細胞的流式細胞術(shù)DNA分析是一個無創(chuàng)、客觀、靈敏、有效的膀胱癌篩查方法。但是本研究的結(jié)果并未達到前人報道的90.0%的診斷準確率，這可能與腫瘤的惡性程度有一定的關(guān)系，惡性程度高的腫瘤細胞容易脫落，就可以檢測出來［9］。

腫瘤細胞的增殖能力顯著超過正常細胞，SPF是反映細胞增殖能力最常用的一個指標，因此SPF的升高就可以提示腫瘤的發(fā)生。本研究顯示腫瘤細胞的SPF＞15%檢出率大于對照組，且在不同腫瘤分級之間無顯著性差異，G0／G1期CV＞9%來判斷腫瘤存在一定的爭議，其受到的影響因素較多，例如尿路感染時CV也可以升高［10］，本研究表明腫瘤細胞G0／G1期CV＞9%的檢出率大于對照組，但在不同腫瘤分級之間無顯著性差異，說明SPF＞15%和G0／G1期CV＞9%不能用于膀胱癌惡性程度的判斷。對照組中異倍體的檢出率為0，但SPF＞15%和G0／G1期CV＞9%兩個指標都可以檢出，提示了流式細胞儀篩查膀胱癌時異倍體是一個特異性的指標，另兩個指標應(yīng)該謹慎，需要結(jié)合尿常規(guī)和其他檢查綜合判斷。本研究顯示膀胱癌患者異倍體細胞檢出對患者復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)示作用，這可能是隨著膀胱癌的惡性度越高、腫瘤分級越低，腫瘤細胞就越容易脫落下來，這樣其檢出率也就會相應(yīng)的增加。

綜上所述，本研究顯示流式細胞術(shù)分析尿脫落細胞診斷膀胱惡性腫瘤具有較好的敏感性和特異性，但在臨床使用中需要結(jié)合尿常規(guī)、影像學(xué)和其他檢查綜合判斷。

［1］El－Gamal EM，Gouida MS.Quantitative changes in p53，Bcl－2and apoptosis in blood and urine of bladder cancer patients［J］.Clin Lab，2013，59（3／4）：349－358.

［2］Volanis D，Papadopoulos G，Doumas K，et al.Molecular mechanisms in urinary bladder carcinogenesis［J］.J BUON，2011，16（4）：589－601.

［3］孫旭東，王含章，王志平.膀胱腫瘤標志物檢測方法的研究進展［J］.現(xiàn)代泌尿外科雜志，2012，17（3）：319－321.

［4］劉波.流式細胞儀及其臨床應(yīng)用［J］.中國醫(yī)療設(shè)備，2013，28（7）：66－69.

［5］馬述春，姜瑋，王彤瑤，等.尿脫落細胞液基薄層細胞學(xué)檢測聯(lián)合DNA定量分析法篩查泌尿系統(tǒng)腫瘤［J］.中國腫瘤臨床與康復(fù)，2013，20（2）：131－133.

［6］Casadio V，Calistri D，Tebaldi M，et al.Urine Cell－Free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis：Preliminary data［J］.Urol Oncol，2013，31（8）：1744－1750.

［7］馬寅芙，方艷秋，趙雪梅，等.DNA倍體聯(lián)合LunX mRNA檢測在非小細胞肺癌胸水中的診斷價值［J］.中國實驗診斷學(xué)，2013，17（4）：666－669.

［8］Karnes RJ，F(xiàn)ernandez CA，Shuber AP.A noninvasive multianalyte urine－based diagnostic assay for urothelial cancer of the bladder in the evaluation of hematuria［J］.Mayo Clin Proc，2012，87（9）：835－842.

［9］陳鈮，龔靜，曾浩，等.尿脫落細胞熒光原位雜交檢測診斷膀胱腫瘤的價值［J］.四川大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，42（1）：109－113.

［10］Xia Y，Liu YL，Yang KH，et al.The diagnostic value of urine－based survivin mRNA test using reverse transcription－polymerase chain reaction for bladder cancer：a systematic review［J］.Chin J Cancer，2010，29（4）：441－446.