苦參堿對慢性心力衰竭大鼠心肌重構的干預作用△

鄭萍，張偉，買淑霞，姚婉霞，鄭捷，戴貴東

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.寧夏回族自治區第三人民醫院，寧夏 銀川 750004；4.凱里學院 化學與材料工程學院，貴州 凱里 556011)

研究開發

苦參堿對慢性心力衰竭大鼠心肌重構的干預作用△

鄭萍1，2，張偉1，2，買淑霞3，姚婉霞1，2，鄭捷1，2，戴貴東4*

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.寧夏回族自治區第三人民醫院，寧夏 銀川 750004；4.凱里學院 化學與材料工程學院，貴州 凱里 556011)

目的：研究苦參堿對異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)致慢性心力衰竭模型大鼠心室重構及心功能衰竭的干預作用。方法：Sprague-Dawley大鼠皮下注射ISO(5 mg·kg-1·d-1，連續7 d)建立大鼠慢性心衰模型，同時觀察苦參堿低(25 mg·kg-1·d-1，連續7 d)、中(50 mg·kg-1·d-1，連續7 d)、高(100 mg·kg-1·d-1，連續7 d)劑量組對模型大鼠體重、心臟質量、心肌組織形態學結構、ODC/SSAT系統蛋白表達的影響。結果：各實驗組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。與空白對照組相比，模型組大鼠心肌肥厚指數和血清心肌損傷標志酶顯著增加，提示模型組大鼠具有顯著性心肌肥厚并伴隨心肌細胞壞死或凋亡；組織病理學顯示模型組大鼠心肌細胞直徑(CD)和橫截面積(CSA)顯著增加，表明大鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞顯著性肥大或增殖，心室發生重構。苦參堿低、中、高劑量組顯著降低心肌肥厚指數(全心濕質量/體質量、左心室濕質量/體質量)；組織病理學結果顯示，苦參堿可顯著減輕大鼠肥厚性心肌組織病理結構的異常改變即抑制心肌細胞肥大；與正常組相比，模型組大鼠心肌組織內ODC、SSAT蛋白含量顯著提高，苦參堿低、中、高劑量組可下調模型大鼠心肌組織ODC蛋白的表達，但對SSAT含量顯著升高無影響。結論：苦參堿對ISO致大鼠心力衰竭模型心室重構及心功能衰竭具有保護作用，與下調心肌組織中ODC蛋白表達、降低心肌組織內多胺的生成相關。

苦參堿；心室重構；異丙腎上腺素；鳥氨酸脫羧酶/精胺乙酰基轉移酶

苦參堿是從寧夏特色回藥材豆科槐屬植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.中提取的具有四環喹嗪啶類結構的生物堿之一，其分子骨架可看作2個喹嗪啶環的稠合體，分子式為C15H24N2O。國內外研究表明，苦參堿具有降血脂、抗心律失常、正性肌力、保護心肌缺血再灌注損傷等多種心血管藥理作用[1-4]。苦參堿抗心室重構的相關研究目前正被很多研究者所關注。多胺包括腐胺(Pu)、精脒(Spd)、精胺(Sp)，廣泛存在于原核及真核生物的組織細胞中，在組織細胞的生長、發育及細胞凋亡中發揮重要的作用[5-6]。研究發現在異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌肥厚大鼠心組織內多胺水平顯著增加，且伴隨著心肌細胞的體積增大和間質纖維化。而給予多胺合成抑制劑治療則逆轉這些病理改變，表明多胺水平的增加和心肌肥厚的發生相關，能夠誘導心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞增殖以及間質纖維化，起到促進心肌肥厚的作用[7]。鳥氨酸脫羧酶(ODC)和精脒/精胺乙酰基轉移酶(SSAT)為多胺合成代謝的2個關鍵酶，所以本研究將通過對大鼠心肌組織內ODC/SSAT等信號通路蛋白表達的測定，明確苦參堿通過對該信號轉導通路發揮抗心室重構的作用。

1 材料

1.1 動物

Sprague-Dawley大鼠60只，雌雄各半，SPF級，體重(250±20)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(寧)2009-0001，預養一周后進行實驗。

1.2 藥品與試劑

苦參堿(寧夏紫荊花藥業股份有限公司，批號：80041122，純度：99.8%)；鹽酸異丙腎上腺素(美國Sigma公司)；烏拉坦(Urethane，中國醫藥上海化學試劑公司)；cTn-I ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；驢抗ODC抗體、驢抗SSAT抗體(Santa Cruz公司)；山羊抗兔IgG-HRP抗體(Cell Signaling公司)、山羊抗驢IgG-HRP抗體(Santa Cruz公司)；增強化學發光底物反應試劑盒(Thermo scientific公司)；兔抗β-actin抗體(北京博奧森公司)。

1.3 儀器

-20 ℃低溫冰箱(合肥榮事達電冰箱有限公司)；-80℃超低溫冰箱(日本三洋電器股份有限公司)；低溫高速離心機(德國赫默公司)；全自動酶標儀(上海Thermo Labsystems公司)；Quantity One凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；PowerPac Basic電泳儀(美國Bio-RAD公司)。

2 方法

2.1模型的建立

SD大鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組：對照組(灌胃給予0.9%氯化鈉溶液7 d；皮下注射0.9%氯化鈉溶液5 mg·kg-1)；模型組(灌胃給予0.9%氯化鈉溶液7 d；皮下注射ISO 5 mg·kg-1)；苦參堿低劑量組(25 mg·kg-1，每天1次，連續7 d)、中劑量組(50 mg·kg-1，每天1次，連續7 d)、高劑量組(100 mg·kg-1，每天1次，連續7 d)。模型組大鼠通過皮下注射ISO，每天1次，連續給藥7 d，建立大鼠心力衰竭模型，實驗周期為7 d。

各組大鼠于末次給藥24 h后，20%烏拉坦(6 mL·kg-1，腹腔注射)麻醉。大鼠右頸總動脈取血，室溫下靜置1 h，低溫離心(4 ℃，3 500 r·min-1，10 min)分離血清，-80 ℃保存，待測。開胸摘取心臟，剪去心耳及周圍結締組織，用預冷的0.9%氯化鈉溶液清洗，濾紙吸干水分，用電子天平準確稱量全心濕質量、左心室(包括室間隔)質量，計算全心濕質量/體質量、左心室濕質量/體質量。取心尖部，用4%多聚甲醛溶液固定，其余左心室組織置于液氮中速凍后，轉入-80 ℃冰箱保存備用。

2.2 心肌組織形態學檢測

將固定于4%多聚甲醛溶液的心肌組織石蠟包埋(制片過程中，統一將左心室朝上，即面向實驗操作者，用手術刀切下心尖，包埋時切面朝向不銹鋼模具底面，模具橫向放置，左心室方向朝向左側，切片方向為左心室至右心室方向)切片4 μm，常規HE染色，光鏡下觀察心肌細胞及心肌間質的變化。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析測量400倍光鏡下HE染色圖片中每個心肌細胞跨核的最窄直徑和心肌細胞橫截面積(每只動物取1張切片，每張切片觀察6個視野，取測量均值)。

2.3 Western blotting檢測

每100 mg經液氮研磨的心肌組織中加入0.7 mL冷裂解緩沖液，冰浴下超聲破碎細胞(4 ℃，10 000 r·min-1離心10 min)取上清蛋白定量，剩余上清液加上樣緩沖液沸水中水浴8 min，冷卻后-20 ℃保存。取蛋白樣本45 μg上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳(初始恒壓80 V，電流為20～40 mA，樣本進入分離膠后提高電壓至120 V，繼續電泳至徹底分離)，200 mA恒定電流轉膜至硝酸纖維素膜，封閉液中室溫搖動，封閉2 h，然后用5%封閉液稀釋的特異性一抗(ODC，1∶500；SSAT，1∶200；β-actin，1∶2 000)孵育，4 ℃過夜。反應完畢后回收一抗，用PBST洗膜3次(10 min/次)，將硝酸纖維素膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(山羊抗兔IgG-HRP抗體，1∶2 000；山羊抗驢IgG-HRP抗體，1∶4 000，用5%封閉液稀釋的二抗)室溫孵育2 h，反應完畢后棄二抗，PBST洗膜3次(10 min/次)。加入增強化學發光底物反應液(A、B試劑以1∶1混合)，曝光膠片。膠片掃描結果經Quantity-one軟件進行分析，計算凈光密度值，將目的條帶的光密度值與其相對應的內參β-actin的光密度值相比以校正誤差，所得比值代表該目的蛋白的相對含量。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 苦參堿對心力衰竭大鼠體重及心臟質量的影響

大鼠初始體重和終末體重在各實驗組間均無差別(P>0.05)；與對照組比較，模型組大鼠心臟質量、左心室質量、全心濕質量/體質量以及左心室濕質量/體質量都顯著增加(P<0.01)，提示ISO可誘導大鼠發生心肌肥厚；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組大鼠心臟質量、左心室質量、全心濕質量/體質量以及左心室濕質量/體質量顯著降低(P<0.01或P<0.05)，提示苦參堿能夠預防ISO致大鼠心肌肥厚。見表1。

3.2 苦參堿對心力衰竭大鼠心肌組織病理改變的影響

心肌組織切片HE染色結果顯示：對照組大鼠心肌組織無異常改變，心肌纖維排列整齊、橫紋清晰、細胞核居中，間質未見血管擴張及炎性細胞的浸潤；模型組大鼠心肌細胞肥大、排列紊亂，間質可見不同程度的細胞凋亡、壞死及炎性細胞浸潤；苦參堿低、中、高劑量組表現為心肌細胞肥大顯著減輕，伴少量炎性細胞浸潤，表明苦參堿預處理顯著減輕了心衰大鼠心肌組織異常改變。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析測量心肌細胞跨核的最窄直徑和心肌細胞橫截面積，可見苦參堿能顯著減輕ISO誘導的心肌細胞肥大(P<0.01)。見表2、圖1。

表1 苦參堿對心力衰竭大鼠體重及心肌質量的影響

注：與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01，下同

表2 苦參堿對慢性心臟衰竭大鼠心肌細胞直徑和心肌細胞橫截面積的影響

A.對照組 B.模型組 C.苦參堿低劑量組 D.苦參堿中劑量組 E.苦參堿高劑量組圖1 苦參堿對ISO誘導慢性心力衰竭大鼠心肌組織形態的影響(HE，×400)

3.3 苦參堿對大鼠心肌組織ODC和SSAT表達的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠心肌組織內ODC和SSAT的表達顯著增高(P>0.05)；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組心肌組織內ODC表達顯著降低，但對心肌組織內SSAT表達無影響。見圖2、圖3。

圖2 苦參堿對心肌慢性心肌衰竭大鼠心肌組織ODC表達的影響

圖3 苦參堿對心肌慢性心肌衰竭大鼠心肌組織SSAT表達的影響

4 討論

依據課題組前期實驗結果及相關文獻[8]，筆者確定了苦參堿的給藥劑量。

心室重構是心肌對各種原因導致的血流動力學超負荷作出的適應性反應，是慢性心力衰竭的重要病理學特征，是多種心血管疾病的共同歸宿，主要表現為心肌細胞肥大、心肌成纖維細胞增殖，并伴隨著間質纖維化。心肌細胞肥大、心肌成纖維細胞增殖以及心肌細胞的凋亡是心室重構的細胞學基礎，心肌纖維化是心室重構的主要病理學特征。本實驗大鼠體重和心臟質量結果提示，ISO可誘導大鼠發生慢性心衰，使心肌細胞肥大，而苦參堿能夠抑制并逆轉大鼠心肌肥厚。病理研究結果顯示，隨著苦參堿劑量的增加，減輕ISO致大鼠肥厚性心肌組織病理學結構的異常改變越來越顯著，其心肌細胞排列逐漸整齊，肥大心肌細胞范圍變小，纖維化、間質水腫和炎細胞浸潤減少，心肌細胞直徑和橫截面積減小，提示苦參堿對ISO致大鼠心肌肥厚的心肌組織形態結構具有保護作用，且苦參堿高劑量組對心肌肥厚的抑制作用強于中、低劑量組。

研究發現，ISO誘導的心肌肥厚大鼠心組織內多胺水平顯著增加，能夠誘導心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞增殖以及間質纖維化，促進心肌肥厚[7]。張雅娟等[9-10]研究表明ISO誘導的心室重構不但表現為心肌細胞的肥大和間質成纖維細胞的增殖及其由成纖維細胞產生的大量膠原纖維，還經常伴隨心肌細胞的凋亡和壞死。 ODC和SSAT為多胺合成代謝的2個關鍵酶，其可被多種應激事件激活，引起多胺合成增加[11]。ODC是多胺合成的初始限速酶，它催化鳥氨酸脫羧基形成腐胺，然后在SSAT的作用下依次加一個丙胺基，分別形成精脒和精胺，然后SSAT分別使精脒和精胺乙酰化形成乙酰化的多胺，最后或被排除細胞或被乙酰多胺氧化酶(APAO)氧化[12]。有研究報道表明ODC的活性可被甲狀腺素以及β受體激動劑等一些刺激心肌肥厚的因子所誘導[13-15]。實際上，ODC活性提高已成為心肌肥厚形成的標志[16]。細胞水平研究也證實ODC可由β腎上腺素能受體刺激的心肌細胞肥大性反應所誘導，其誘導對β腎上腺素能受體刺激這一細胞體系的肥大性反應起主要作用[17]。SSAT極易被調控，其含量大小根據多胺含量的多少而進行調節，以維持多胺的靜態平衡。研究顯示[18]皮下注射ISO會使心臟ODC活性和多胺水平顯著增加；進一步研究證實多胺是促進ISO介導的大鼠心肌損傷的細胞內因子之一[19]。另外在ISO誘導的心肌肥厚大鼠心肌組織中也可見ODC和SSAT蛋白表達顯著增加[20]。

本實驗結果顯示，ISO組大鼠心肌組織內ODC和SSAT蛋白表達較對照組顯著上調，這與已報道實驗結果相一致，而苦參堿預防給藥后則顯著下調ISO組ODC蛋白表達的增多，但對SSAT含量顯著性升高無影響。筆者認為苦參堿抗大鼠心肌肥厚的作用是通過下調心肌組織中ODC蛋白的表達，減少多胺的生成，抑制多胺對心肌的肥大性刺激，從而發揮抗心室重構的作用。

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InterventionEffectofMatrineonMyocardialRemodelingofChronicHeartFailureinRats

ZHENG Ping1，2，ZHANGWei1，2，MAIShuxia1，2，YAOWanxia1，2，ZHENGJie1，2，DAIGuidong3*

(1.DepartmentofPharmacology，SchoolofPharmacy，NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China；2.NingxiaEngineering&TechnologyResearchCenterforModernizationofHuiMedicine，Yinchuan750004，China；3.TheThirdHospitalofNingxia，Yinchuan750021，China；4.DepartmentofPharmaceuticalEngineering，SchoolofChemicalandMaterialsEngineering，KailiUniversity，Kaili556011，China)

Objective：This study was designed to explore the intervention effect of matrine on cardiac remodeling and heart failurein isoproterenol-induced chronic heart failure model in rats.Methods：Heart failure model was established in Sprague-Dawley rats by daily subcutaneous injection of isoproterenol(ISO，5 mg·kg-1·d-1)for seven days.Simultaneously，the effect to rat body weights，heart weights，myocardial tissue morphological structureand ODC/SSAT protein expression systemwere observed for matrine dosage groupon low(25 mg·kg-1·d-1for seven dayscontinuously)，medium(50 mg·kg-1·d-1for seven days continuously)and high(100 mg·kg-1·d-1)level.Results：The rat body weights had no significant differences among all groups(P>0.05).Compared with the control，myocardial hypertrophy indexes and serum myocardial injury biomarker were increased，which shown that the rats in ISO group had significant myocardial hypertrophy with cell necrosis or apoptosis.Histopathological examination demonstrated that CD and CSA were significantly increased，which demonstrated that myocardial cell and cardiac fibroblasts were become hypertrophy，hyperplasia or ventricular remodeling significantly.Oral administration of matrine(25，50 or 100 mg·kg-1·d-1for 7 days respectively)significantly reduced the increased myocardial hypertrophy indexes in ISO-induced heart failure rats.Histopathological examination demonstrated that matrine could reduce the abnormal change of hypertrophic myocardium tissue pathology structurein the isoproterenol-induced heart failure rats.Compared with the control，the protein levels of ODC and SSAT in myocardial tissuewere significantly increased.Matrine(25，50，100 mg·kg-1level)treatment could significantly reducethe expression of ODCprotein，but it had no effect onthe increase of the content forSSAT in isoproterenol group.Conclusion：Matrine could protect the ventricular remodeling and cardiac function failurein ISO-induced chronic heart failure in rats，which was relative to the down-regulation of the expression for ODC protein and decrease the produce of polyamine in myocardial tissue.

Matrine；Cardiac remodeling；Isoproterenol；ODC/SSAT

2014-07-05)

教育部新世紀優秀人才支持計劃(NECT-06-0916)

*

戴貴東，教授，博士，碩士生導師，研究方向：心血管藥理和腫瘤藥理；Tel：(0855)8558093，E-mail：daiguidong@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.004