冰凍亞型紅細胞融化洗滌后保存條件及使用效期的優化選擇

邱玉霞　韓惠云　張國平等

[摘要] 目的 優化選擇冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存條件及使用效期，保證其在血型血清學試驗中的應用效果。 方法 從冰凍保存的亞型紅細胞中，選擇10份儲存量較大、弱抗原與抗血清的反應強度為2﹢～3﹢ 的標本，融化洗滌后將壓積紅細胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時，分別檢測四組紅細胞上清中的FHb含量及紅細胞A、B抗原的反應強度。以紅細胞每天置室溫1h再恢復2～6℃儲存的模式下，FHb濃度達1.0g/L，同時紅細胞血型抗原減弱達1﹢的最小儲存天數再減10d作為其使用效期。 結果 （1）四組紅細胞隨著保存時間延長，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時間越長，上升幅度越大；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，FHb達到1.0g/L的時間分別為>60d、60d、50d、30d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為50、40、30、10d。（2）四組紅細胞隨著保存時間延長，紅細胞血型抗原的反應強度逐漸減弱；室溫放置時間越長，抗原出現減弱的時間越早；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達到1﹢的時間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為>60、60、50、20d。 結論 冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存質量與保存介質、溫度、時間密切相關。以MAP紅細胞保存液作為保存介質，置2～6℃冰箱儲存，室溫下使用時間每天控制在1h以內為其最佳保存條件；以MAP紅細胞保存液作為保存介質的使用效期確定為40d；以血漿作為保存介質的使用效期則確定為20d。

[關鍵詞] 冰凍亞型紅細胞；融化洗滌；保存；質量

[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）17-12-04

[Abstract] Objective To optimize the preservation conditions and validity period of frozen subgroup red blood cells after melting and washing to ensure its effects in blood group serology test. Methods 10 samples with large storage capacity and weak antigenicity and antiserum reaction intensity of 2+-3+ were selected from frozenly preserved subgroup red blood cells. After melting and washing， the packed red blood cells were divided into two shares which were mixed with 1.5 times of AB subgroup plasma and MAP red blood cell preservation fluid for suspension. Adding gentamicin sulfate with final concentration of 0.05mg/mL then equally diving each of the two shares into four groups. Group 1 was preserved in the fridge under temperature of 2-6℃， and Group 2， 3 and 4 were kept under room temperature for 0.5h， 1h and 2h each day before preservation in the fridge under temperature of 2-6℃. The supernatant FHb content and the reaction intensity of red blood cell antigen A and B were tested at 0d， 10d， 20d， 30d， 40d， 50d and 60d after preservation. With red blood cells kept under room temperature for 1h each day before preservation in the fridge under temperature of 2-6℃， the validity period was defined as the minimal storage days （for FHb concentration to reach 1.0g/L and the blood group antigen reaction intensity to decrease to 1+） minus 10d. Results （1） The supernatant FHb content gradually increased with prolonged preservation of red blood cells， the longer preservation under room temperature， the greater increase. With MAP as the preservation medium， it took >60d， 60d， 50d， 30d for FHb to reach 1.0g/L for red blood cells kept under room temperature for 0h， 0.5h， 1h and 2h respectively. With AB subgroup plasma as the preservation medium， it took 50d， 40d， 30d and 10d respectively. （2） Blood group antigen reaction intensity gradually decreased with prolonged preservation of red blood cells， the longer preservation under room temperature， the earlier appearance of decreased antigen reaction intensity. With MAP as the preservation medium， it took >60d， >60d， 60d， 40d for the blood group antigen reaction intensity to decrease to 1+ for red blood cells kept under room temperature for 0h， 0.5h， 1h and 2h respectively. With AB subgroup plasma as the preservation medium， it took>60d， 60d， 50d， s0d respectively. Conclusion The preservation quality of frozen subgroup red blood cells after melting and washing is closely related to the preservation medium， temperature and time. The optimal preservation conditions are as follows： using MAP red blood cell preservation fluid as the preservation medium， preservation in fridge under temperature of 2-6℃， application under room temperature for no more than 1h each day. The validity period was defined as 40d with MAP red blood cell preservation fluid as the preservation medium and 20d with plasma as the preservation medium.endprint

[Key words] Frozen subgroup red blood cell； Melting and washing； Preservation； Quality

甘油作為最常用的細胞內低溫保護劑，已廣泛應用于紅細胞的低溫保存。利用該方法保存紅細胞，可使紅細胞壽命長達10年，甚至延長到21年[1]。我站利用該原理對日常工作中遇到的ABO亞型標本進行冰凍保存，并作為弱陽性參考品對多家單克隆抗血清試劑進行質量評價，從中挑選對亞型檢出率高的試劑用于獻血者血型鑒定的初、復檢，在一定程度上提高了獻血者的ABO亞型檢出率[2-3]。為進一步將ABO亞型紅細胞作為弱陽性質控品，有效應用于獻血者ABO血型鑒定的室內質控及醫院供血庫ABO血型鑒定的質量測評等工作中，本研究對冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存條件及使用效期進行優化選擇，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9%Nacl注射液、抗-A、抗-B（上海血液生物醫藥有限責任公司）；1.6%Nacl溶液（由9%和0.9%Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測定試劑盒（北京瑞爾達生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團有限公司）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫療儀器廠）；LD5-2A型臺式離心機（北京雷勃爾公司）。

1.2 紅細胞分組和保存

從本站建立的冰凍亞型紅細胞信息庫[4]中，選擇10份儲存量較大、弱抗原與抗血清的反應強度為2+～3+的標本，融化洗滌后將壓積紅細胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時，分別檢測四組紅細胞相關質量指標。

1.3 紅細胞質量指標檢測

用鄰甲聯苯胺法檢測紅細胞上清中FHb含量；用鹽水試管法[5]檢測紅細胞A、B抗原。以紅細胞每天置室溫1h再恢復2～6℃儲存的模式下，FHb濃度達1.0g/L，同時紅細胞血型抗原減弱達1+的最小儲存天數再減10d作為其使用效期。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件，FHb檢測數據用（）表示，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1、表2。

3 討論

紅細胞在體外保存過程中可發生一系列生物和毒性改變，且隨著儲存時間的延長其變化更加顯著，統稱為“紅細胞保存損傷”。包括細胞形態變化、膜結構改變、ATP含量減少、乳酸堆積、K+的流失和Na+的聚集等，其中細胞膜帶3蛋白結構的變化和脂質過氧化物反應引起的氧化損傷，可導致紅細胞發生裂解[6]，不但嚴重影響紅細胞血型抗原成分的穩定性，而且使細胞內的Hb游離出細胞外。所以測定紅細胞抗原的反應性和上清中FHb濃度，可反映紅細胞膜的破壞情況，是評價紅細胞保存質量的重要指標。本研究通過分組設計，重點觀察不同保存介質、保存溫度及保存時間對紅細胞抗原及FHb的影響程度，從而確定冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的最佳保存條件及使用效期，以保證其在血型血清學試驗中的應用效果。

由表1可見，四組紅細胞隨著保存時間延長，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時間越長，上升幅度越大；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，FHb達到1.0g/L的時間分別為>60、60、50、30d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為50、40、30、10d。由表2可見，四組紅細胞隨著保存時間延長，紅細胞血型抗原的反應強度逐漸減弱；室溫放置時間越長，抗原出現減弱的時間越早；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達到1+的時間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為>60、60、50、20d。由此可見，冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存質量與紅細胞的保存介質、保存溫度和保存時間密切相關，也充分證明優化選擇紅細胞保存條件及使用效期的重要性和必要性。

從紅細胞的保存介質進行分析，由于紅細胞沒有細胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產生ATP的同時，也會產生乳酸和丙酮酸等代謝產物，這些產物在體內可被其他組織氧化利用，而在體外狀態下卻因得不到充分利用而使其pH下降，而pH過低時會引起ATP從紅細胞中的釋放速率加快，導致紅細胞ATP耗竭，從而使紅細胞壽命走向終結[7-8]。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細胞保存液作為保存介質，在一定時間內，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細胞提供足夠的ATP[9-11]，甘露醇則具有抵抗紅細胞溶解和加固細胞膜的作用，所以能有效維持紅細胞的形態與結構，其保存效果明顯優于血漿介質。從紅細胞的保存溫度及保存時間進行分析，因為血液是一種熱敏物質，對溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細胞代謝速率越快，能量消耗越多[12-13]，隨著保存介質中營養物質的不斷消耗以及代謝產物的逐漸堆積，進一步加重了紅細胞的儲存損傷，繼而使紅細胞裂解死亡。所以，紅細胞在2～6℃冰箱保存效果最好，工作中應盡量縮短室溫放置時間，從而有效保證紅細胞的儲存質量。

綜上考慮，冰凍亞型紅細胞融化洗滌后，以MAP紅細胞保存液作為保存介質，于2～6℃冰箱中儲存效果最佳，工作中每天室溫使用時間應控制在1h以內，且時間越短，保存質量越好。紅細胞用MAP保存液保存時，使用有效期確定為40d。該方法適用于將冰凍亞型紅細胞作為弱陽性質控品，用于無償獻血者ABO血型鑒定室內質控時所需質控品的制備和保存。紅細胞用血漿作為保存介質時，使用有效期確定為20d。該方法適用于對醫療機構供血庫進行ABO血型鑒定質量測評、供血庫輸血技能比武以及血型血清學培訓等工作中所需亞型標本的制備和保存。其他工作中如果紅細胞能在20d內使用完畢，對懸浮介質也無特殊要求，比如對單克隆試劑進行質量評價、輔助鑒定某些亞型等，則不論選擇哪一種保存方法，均能保證紅細胞的使用效果。

[參考文獻]

[1] 龔裕春，黃晨佳，邱穎婕，等.2組洗滌溶液制備冰凍解凍去甘油紅細胞的效果比較[J].中國輸血雜志，2010，23（9）：692-693.

[2] 李雪英，田宗斌，邱玉霞，等.6種ABO單克隆抗體試劑的質量評估[J].臨床輸血與檢驗，2012，14（4）：324-326.

[3] 邱玉霞，竇茉莉，李雪英.冰凍亞型紅細胞在抗血清試劑選擇中的應用[J].中國醫學創新，2012，9（19）：70-71.

[4] 李雪英，邱玉霞，竇茉莉.冰凍亞型紅細胞的保存及應用[J].山東醫藥，2012，52（35）：90-91.

[5] 葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京：東南大學出版社，2006：246-271.

[6] 魏超，莊遠，汪德清.紅細胞保存時間與功能變化的研究進展[J].中國輸血雜志，2013，26（11）：1152-1155.

[7] 武世文，文愛清.紅細胞儲存損傷的研究進展[J].中國輸血雜志，2013，26（6）：593-595.

[8] 于青，劉嘉馨，王紅，等.紅細胞老化及其機制的研究進展[J].中國輸血雜志，2012，25（1）：77-80.

[9] 王殿昌，馬玉翠，王秀英，等.MAP紅細胞懸液保存期內生化指標的動態觀察[J].中國醫科大學學報，2006，35（2）：207-208.

[10] 李建民，沈莉，張義兵，等.MAP洗滌和保存紅細胞的效果觀察[J].中國輸血雜志，2003，16（2）：104-106.

[11] 沈莉，張義兵，李建民，等.兩種洗液制備的洗滌紅細胞的對比[J].中國輸血雜志，2003，16（1）：28-29.

[12] 馬慶，陸瑤，徐雪瑾，等.紅細胞深低溫長期保存效果的探討[J].中國輸血雜志，2007，20（1）：45-47.

[13] 馬慶.深低溫長期保存紅細胞的效果評價[J].中國輸血雜志，2012，25（9）：837-840.

（收稿日期：2014-06-08）endprint

[Key words] Frozen subgroup red blood cell； Melting and washing； Preservation； Quality

甘油作為最常用的細胞內低溫保護劑，已廣泛應用于紅細胞的低溫保存。利用該方法保存紅細胞，可使紅細胞壽命長達10年，甚至延長到21年[1]。我站利用該原理對日常工作中遇到的ABO亞型標本進行冰凍保存，并作為弱陽性參考品對多家單克隆抗血清試劑進行質量評價，從中挑選對亞型檢出率高的試劑用于獻血者血型鑒定的初、復檢，在一定程度上提高了獻血者的ABO亞型檢出率[2-3]。為進一步將ABO亞型紅細胞作為弱陽性質控品，有效應用于獻血者ABO血型鑒定的室內質控及醫院供血庫ABO血型鑒定的質量測評等工作中，本研究對冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存條件及使用效期進行優化選擇，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9%Nacl注射液、抗-A、抗-B（上海血液生物醫藥有限責任公司）；1.6%Nacl溶液（由9%和0.9%Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測定試劑盒（北京瑞爾達生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團有限公司）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫療儀器廠）；LD5-2A型臺式離心機（北京雷勃爾公司）。

1.2 紅細胞分組和保存

從本站建立的冰凍亞型紅細胞信息庫[4]中，選擇10份儲存量較大、弱抗原與抗血清的反應強度為2+～3+的標本，融化洗滌后將壓積紅細胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時，分別檢測四組紅細胞相關質量指標。

1.3 紅細胞質量指標檢測

用鄰甲聯苯胺法檢測紅細胞上清中FHb含量；用鹽水試管法[5]檢測紅細胞A、B抗原。以紅細胞每天置室溫1h再恢復2～6℃儲存的模式下，FHb濃度達1.0g/L，同時紅細胞血型抗原減弱達1+的最小儲存天數再減10d作為其使用效期。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件，FHb檢測數據用（）表示，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1、表2。

3 討論

紅細胞在體外保存過程中可發生一系列生物和毒性改變，且隨著儲存時間的延長其變化更加顯著，統稱為“紅細胞保存損傷”。包括細胞形態變化、膜結構改變、ATP含量減少、乳酸堆積、K+的流失和Na+的聚集等，其中細胞膜帶3蛋白結構的變化和脂質過氧化物反應引起的氧化損傷，可導致紅細胞發生裂解[6]，不但嚴重影響紅細胞血型抗原成分的穩定性，而且使細胞內的Hb游離出細胞外。所以測定紅細胞抗原的反應性和上清中FHb濃度，可反映紅細胞膜的破壞情況，是評價紅細胞保存質量的重要指標。本研究通過分組設計，重點觀察不同保存介質、保存溫度及保存時間對紅細胞抗原及FHb的影響程度，從而確定冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的最佳保存條件及使用效期，以保證其在血型血清學試驗中的應用效果。

由表1可見，四組紅細胞隨著保存時間延長，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時間越長，上升幅度越大；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，FHb達到1.0g/L的時間分別為>60、60、50、30d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為50、40、30、10d。由表2可見，四組紅細胞隨著保存時間延長，紅細胞血型抗原的反應強度逐漸減弱；室溫放置時間越長，抗原出現減弱的時間越早；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達到1+的時間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為>60、60、50、20d。由此可見，冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存質量與紅細胞的保存介質、保存溫度和保存時間密切相關，也充分證明優化選擇紅細胞保存條件及使用效期的重要性和必要性。

從紅細胞的保存介質進行分析，由于紅細胞沒有細胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產生ATP的同時，也會產生乳酸和丙酮酸等代謝產物，這些產物在體內可被其他組織氧化利用，而在體外狀態下卻因得不到充分利用而使其pH下降，而pH過低時會引起ATP從紅細胞中的釋放速率加快，導致紅細胞ATP耗竭，從而使紅細胞壽命走向終結[7-8]。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細胞保存液作為保存介質，在一定時間內，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細胞提供足夠的ATP[9-11]，甘露醇則具有抵抗紅細胞溶解和加固細胞膜的作用，所以能有效維持紅細胞的形態與結構，其保存效果明顯優于血漿介質。從紅細胞的保存溫度及保存時間進行分析，因為血液是一種熱敏物質，對溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細胞代謝速率越快，能量消耗越多[12-13]，隨著保存介質中營養物質的不斷消耗以及代謝產物的逐漸堆積，進一步加重了紅細胞的儲存損傷，繼而使紅細胞裂解死亡。所以，紅細胞在2～6℃冰箱保存效果最好，工作中應盡量縮短室溫放置時間，從而有效保證紅細胞的儲存質量。

綜上考慮，冰凍亞型紅細胞融化洗滌后，以MAP紅細胞保存液作為保存介質，于2～6℃冰箱中儲存效果最佳，工作中每天室溫使用時間應控制在1h以內，且時間越短，保存質量越好。紅細胞用MAP保存液保存時，使用有效期確定為40d。該方法適用于將冰凍亞型紅細胞作為弱陽性質控品，用于無償獻血者ABO血型鑒定室內質控時所需質控品的制備和保存。紅細胞用血漿作為保存介質時，使用有效期確定為20d。該方法適用于對醫療機構供血庫進行ABO血型鑒定質量測評、供血庫輸血技能比武以及血型血清學培訓等工作中所需亞型標本的制備和保存。其他工作中如果紅細胞能在20d內使用完畢，對懸浮介質也無特殊要求，比如對單克隆試劑進行質量評價、輔助鑒定某些亞型等，則不論選擇哪一種保存方法，均能保證紅細胞的使用效果。

[參考文獻]

[1] 龔裕春，黃晨佳，邱穎婕，等.2組洗滌溶液制備冰凍解凍去甘油紅細胞的效果比較[J].中國輸血雜志，2010，23（9）：692-693.

[2] 李雪英，田宗斌，邱玉霞，等.6種ABO單克隆抗體試劑的質量評估[J].臨床輸血與檢驗，2012，14（4）：324-326.

[3] 邱玉霞，竇茉莉，李雪英.冰凍亞型紅細胞在抗血清試劑選擇中的應用[J].中國醫學創新，2012，9（19）：70-71.

[4] 李雪英，邱玉霞，竇茉莉.冰凍亞型紅細胞的保存及應用[J].山東醫藥，2012，52（35）：90-91.

[5] 葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京：東南大學出版社，2006：246-271.

[6] 魏超，莊遠，汪德清.紅細胞保存時間與功能變化的研究進展[J].中國輸血雜志，2013，26（11）：1152-1155.

[7] 武世文，文愛清.紅細胞儲存損傷的研究進展[J].中國輸血雜志，2013，26（6）：593-595.

[8] 于青，劉嘉馨，王紅，等.紅細胞老化及其機制的研究進展[J].中國輸血雜志，2012，25（1）：77-80.

[9] 王殿昌，馬玉翠，王秀英，等.MAP紅細胞懸液保存期內生化指標的動態觀察[J].中國醫科大學學報，2006，35（2）：207-208.

[10] 李建民，沈莉，張義兵，等.MAP洗滌和保存紅細胞的效果觀察[J].中國輸血雜志，2003，16（2）：104-106.

[11] 沈莉，張義兵，李建民，等.兩種洗液制備的洗滌紅細胞的對比[J].中國輸血雜志，2003，16（1）：28-29.

[12] 馬慶，陸瑤，徐雪瑾，等.紅細胞深低溫長期保存效果的探討[J].中國輸血雜志，2007，20（1）：45-47.

[13] 馬慶.深低溫長期保存紅細胞的效果評價[J].中國輸血雜志，2012，25（9）：837-840.

（收稿日期：2014-06-08）endprint

[Key words] Frozen subgroup red blood cell； Melting and washing； Preservation； Quality

甘油作為最常用的細胞內低溫保護劑，已廣泛應用于紅細胞的低溫保存。利用該方法保存紅細胞，可使紅細胞壽命長達10年，甚至延長到21年[1]。我站利用該原理對日常工作中遇到的ABO亞型標本進行冰凍保存，并作為弱陽性參考品對多家單克隆抗血清試劑進行質量評價，從中挑選對亞型檢出率高的試劑用于獻血者血型鑒定的初、復檢，在一定程度上提高了獻血者的ABO亞型檢出率[2-3]。為進一步將ABO亞型紅細胞作為弱陽性質控品，有效應用于獻血者ABO血型鑒定的室內質控及醫院供血庫ABO血型鑒定的質量測評等工作中，本研究對冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存條件及使用效期進行優化選擇，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

9%Nacl注射液（北京博得桑特輸血器材公司）；0.9%Nacl注射液、抗-A、抗-B（上海血液生物醫藥有限責任公司）；1.6%Nacl溶液（由9%和0.9%Nacl注射液按比例配制）；血漿游離血紅蛋白測定試劑盒（北京瑞爾達生物科技有限公司）；硫酸慶大霉素（開封制藥集團有限公司）；MDF-192型-80℃低溫冰箱（大連三洋冷鏈公司）；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱（北京光明醫療儀器廠）；LD5-2A型臺式離心機（北京雷勃爾公司）。

1.2 紅細胞分組和保存

從本站建立的冰凍亞型紅細胞信息庫[4]中，選擇10份儲存量較大、弱抗原與抗血清的反應強度為2+～3+的標本，融化洗滌后將壓積紅細胞各一分為二，分別以AB型血漿和MAP紅細胞保存液按1.5倍的比例懸浮，加入終濃度為0.05mg/mL的硫酸慶大霉素混勻后，再各等分為1、2、3、4四組，第1組始終放置2～6℃冰箱保存，第2、3、4組每天在室溫分別放置0.5、1和2h后，再放入2～6℃冰箱保存，于保存0、10、20、30、40、50、60d時，分別檢測四組紅細胞相關質量指標。

1.3 紅細胞質量指標檢測

用鄰甲聯苯胺法檢測紅細胞上清中FHb含量；用鹽水試管法[5]檢測紅細胞A、B抗原。以紅細胞每天置室溫1h再恢復2～6℃儲存的模式下，FHb濃度達1.0g/L，同時紅細胞血型抗原減弱達1+的最小儲存天數再減10d作為其使用效期。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件，FHb檢測數據用（）表示，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1、表2。

3 討論

紅細胞在體外保存過程中可發生一系列生物和毒性改變，且隨著儲存時間的延長其變化更加顯著，統稱為“紅細胞保存損傷”。包括細胞形態變化、膜結構改變、ATP含量減少、乳酸堆積、K+的流失和Na+的聚集等，其中細胞膜帶3蛋白結構的變化和脂質過氧化物反應引起的氧化損傷，可導致紅細胞發生裂解[6]，不但嚴重影響紅細胞血型抗原成分的穩定性，而且使細胞內的Hb游離出細胞外。所以測定紅細胞抗原的反應性和上清中FHb濃度，可反映紅細胞膜的破壞情況，是評價紅細胞保存質量的重要指標。本研究通過分組設計，重點觀察不同保存介質、保存溫度及保存時間對紅細胞抗原及FHb的影響程度，從而確定冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的最佳保存條件及使用效期，以保證其在血型血清學試驗中的應用效果。

由表1可見，四組紅細胞隨著保存時間延長，上清FHb均逐漸升高；室溫放置時間越長，上升幅度越大；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，FHb達到1.0g/L的時間分別為>60、60、50、30d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為50、40、30、10d。由表2可見，四組紅細胞隨著保存時間延長，紅細胞血型抗原的反應強度逐漸減弱；室溫放置時間越長，抗原出現減弱的時間越早；以MAP作為保存介質，每天室溫分別放置0、0.5、1、2h，血型抗原減弱達到1+的時間分別為>60、>60、60、40d；以AB型血漿作為保存介質，則分別為>60、60、50、20d。由此可見，冰凍亞型紅細胞融化洗滌后的保存質量與紅細胞的保存介質、保存溫度和保存時間密切相關，也充分證明優化選擇紅細胞保存條件及使用效期的重要性和必要性。

從紅細胞的保存介質進行分析，由于紅細胞沒有細胞核和線粒體，只能通過無氧酵解利用葡萄糖獲取能量。在分解葡萄糖產生ATP的同時，也會產生乳酸和丙酮酸等代謝產物，這些產物在體內可被其他組織氧化利用，而在體外狀態下卻因得不到充分利用而使其pH下降，而pH過低時會引起ATP從紅細胞中的釋放速率加快，導致紅細胞ATP耗竭，從而使紅細胞壽命走向終結[7-8]。如果選擇含有枸櫞酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇等成分的MAP紅細胞保存液作為保存介質，在一定時間內，其中的葡萄糖和腺嘌呤可為保存過程中的紅細胞提供足夠的ATP[9-11]，甘露醇則具有抵抗紅細胞溶解和加固細胞膜的作用，所以能有效維持紅細胞的形態與結構，其保存效果明顯優于血漿介質。從紅細胞的保存溫度及保存時間進行分析，因為血液是一種熱敏物質，對溫度變化十分敏感，溫度越高，紅細胞代謝速率越快，能量消耗越多[12-13]，隨著保存介質中營養物質的不斷消耗以及代謝產物的逐漸堆積，進一步加重了紅細胞的儲存損傷，繼而使紅細胞裂解死亡。所以，紅細胞在2～6℃冰箱保存效果最好，工作中應盡量縮短室溫放置時間，從而有效保證紅細胞的儲存質量。

綜上考慮，冰凍亞型紅細胞融化洗滌后，以MAP紅細胞保存液作為保存介質，于2～6℃冰箱中儲存效果最佳，工作中每天室溫使用時間應控制在1h以內，且時間越短，保存質量越好。紅細胞用MAP保存液保存時，使用有效期確定為40d。該方法適用于將冰凍亞型紅細胞作為弱陽性質控品，用于無償獻血者ABO血型鑒定室內質控時所需質控品的制備和保存。紅細胞用血漿作為保存介質時，使用有效期確定為20d。該方法適用于對醫療機構供血庫進行ABO血型鑒定質量測評、供血庫輸血技能比武以及血型血清學培訓等工作中所需亞型標本的制備和保存。其他工作中如果紅細胞能在20d內使用完畢，對懸浮介質也無特殊要求，比如對單克隆試劑進行質量評價、輔助鑒定某些亞型等，則不論選擇哪一種保存方法，均能保證紅細胞的使用效果。

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（收稿日期：2014-06-08）endprint