細粒棘球蚴B抗原對1型糖尿病牙齦白細胞介素-2、白細胞介素-4表達的影響

哈德麗婭·加帕爾，伊力多斯·艾合他木夫，阿依甫汗·阿汗

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院VIP內科三科，烏魯木齊 830054）

·基礎研究·

細粒棘球蚴B抗原對1型糖尿病牙齦白細胞介素-2、白細胞介素-4表達的影響

哈德麗婭·加帕爾，伊力多斯·艾合他木夫，阿依甫汗·阿汗

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院VIP內科三科，烏魯木齊 830054）

目的研究細粒棘球蚴B抗原（EgB）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的1型糖尿病（T1DM）模型小鼠牙齦組織中白細胞介素-2（IL-2）及白細胞介素-4（IL-4）表達產生的影響。方法雌性10周齡STZ誘導的T1DM模型小鼠20只，隨機分為2組，每組10只，處理組給予EgB 100μg／10 g連續(xù)5 d腹腔注射，對照組給予同等劑量0.9%氯化鈉注射溶液腹腔注射，取其牙齦組織，用熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）檢測牙齦中IL-2、IL-4 mRNA表達。結果IL-2 mRNA在EgB處理組較對照組表達明顯下降（P＜0.05）；IL-4 mRNA在EgB處理組較對照組表達明顯上升（P＜0.05）。結論EgB處理STZ誘導的T1DM模型小鼠，使其牙齦中IL-2 mRNA表達降低，IL-4 mRNA表達升高，影響T1DM免疫應答機制。

糖尿病，1型；牙齦炎；白細胞介素2；白細胞介素4；細粒棘球絳蟲；疾病模型，動物

圖1 IL-2、IL-4及β-actinPCR擴增產物電泳圖

肝細胞生長因子聯合擷沙坦對自發(fā)險高血壓大鼠心肌細胞凋亡的影響

EgB為細粒棘球絳蟲（又稱包蟲）包囊液中主要成分，具有很強免疫源性，目前多數研究認為其通過抑制T淋巴細胞發(fā)揮誘導免疫耐受作用，感染EgB后宿主體內嗜酸性粒細胞及IgE、IgG1和IgG4水平均增高已被研究證明，提示EgB感染引導免疫調節(jié)向利于細粒棘球絳蟲寄生的Th2方向移動［1］。

1型糖尿病（T1DM）是自身免疫性疾病，由T細胞介導，其病程中影響免疫病理的為Th1／Th2細胞亞群失衡及其引起的細胞因子改變［2］。牙齦炎為T1DM第六位的并發(fā)癥［3］，其本身并不引起牙齦炎，但可促進牙齦炎的發(fā)生發(fā)展［4］。已有實驗通過對糖尿病大鼠與正常大鼠牙周組織CD4、CD8的檢測，發(fā)現糖尿病大鼠牙周組織CD4、CD8升高，提示糖尿病大鼠牙周組織細胞免疫功能可能發(fā)生改變，存在免疫調節(jié)功能和T細胞活化異常［4］。

應用免疫干預手段達到阻止胰島的自身免疫過程，預防或減輕T1DM對靶器官的損害，成為當今研究的一大熱點。近年來的研究發(fā)現，在蠕蟲感染率較高的發(fā)展中國家T1DM發(fā)病率較低，而在蠕蟲感染率較低的發(fā)達國家T1DM發(fā)病率較高，蠕蟲感染較低T1DM發(fā)病率已由動物實驗得以證實［5］。本研究建立鏈脲佐菌素（STZ）誘導的T1DM模型小鼠，結合包蟲病為本地區(qū)特色寄生蟲病，從國際該領域前沿探討EgB是否影響T1DM牙齦組織IL-2、IL-4表達水平，從而調控Th1／Th2亞群的平衡，從細胞因子表達水平探索EgB是否可從免疫干預和免疫耐受的角度減輕T1DM對牙齦組織的損害提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性20只清潔小鼠，體質量（20.0±2.0）g，購于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物中心。

1.1.2 試劑 STZ（美國sigma公司，臨用前以pH4.5檸檬酸緩沖液配制）、濃度為0.54 mg／L的EgB（由包蟲病研究所惠贈）、Trizol（美國Invitrogen公司）、DEPC（美國sigma公司）、5×TBE電泳緩沖液（臨用前稀釋成0.5×TBE緩沖液使用）、Goldviewna II型核酸染色液（博大泰克生物基因技術有限責任公司，北京）、瓊脂糖（西班牙BIOWEST公司）、50 bp marker（廣東東盛生物科技有限公司，用于電泳分析）、反轉錄試劑盒（美國Promega公司）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（百泰克生物技術有限公司DP1062，北京）、2×Taq PCR Master Mix（天根生化）、熒光定量試劑盒（美國Invitrogen公司）、PCR引物（由生工生物工程股份有限公司合成，上海）、SYBR premix EX TAP（Tli RNaseH Plus）（大連TaKaRa）。

1.1.3 引物的設計與合成 在Genebank中找到β-actin、IL-2mRNA、IL-4mRNA全基因序列，應用Primer5軟件進行分析，由上海生物工程公司設計與合成。

1.1.4 實驗儀器 高速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：LXJ-2B），電泳儀（美國BIO RAD），凝膠成像儀（AIphaImager HP），核酸蛋白定量儀（BioPhotometer Plus）、實時熒光定量儀（美國BIO RAD，IQ5），PCR擴增儀（美國BIO RAD，C1000）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 雌性6～8周齡清潔小鼠20只，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物房內（SPF級），購置的小鼠于動物房內常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周使其適應環(huán)境，1周后20只小鼠按50 mg·kg-1·d-1的劑量連續(xù)5 d腹腔注射STZ誘導T1DM發(fā)病（注射前禁食8 h，不禁水），血糖值超過16.7mmol／L且次日復測仍為此水平，提示小鼠T1DM模型造模成功（20只小鼠兩次血糖監(jiān)測均超過16.7 mmol／L）。隨機編號分組：（1）EgB處理組：10只，給予EgB，濃度為0.54 mg／L，100μg／10 g經腹腔注射，連續(xù)給藥5 d；（2）對照組：10只，給予同等劑量0.9%氯化鈉注射溶液經腹腔注射，連續(xù)給藥5 d。

1.2.2 樣本的收集與保存 40周末采用頸椎脫臼法處死小鼠，取其牙齦組織，用鹽水清洗用鋁后箔包裹編號，快速投入液氮至-80℃冰箱凍存待用。

1.2.3 總RNA的提取 Trizol一步法——按每100 mg牙齦組織加入1mL Trizol試劑比例加入Trizol試劑至放有組織塊的勻漿器中，按Trizol試劑說明書操作提取牙齦總RNA。將抽提出的RNA按100倍稀釋，核酸蛋白定量儀測定A260／A280（單位：OD）比值檢驗純度（測定比值在1.8～2.0之間用于PCR）；并記錄RNA濃度。

表1 引物序列

1.2.4 cDNA的制備 20μL反應體系：①下列混合物在Microtube管內配制：2μL dNTP Mixture（10 mM each）、1μL Oligo（dT）s Primer（0.5μg／μL）、1μg總RNA（根據RNA濃度計算每個樣本RNA取用量）加上Nuclear-Free Water至10μL；②在PCR儀上進行變性、退火反應：65℃5 min，4℃forever；③Microtube管置離心機離心數秒使混合液聚集于管底部；④在上述變性、退火后的反應液里加入2μL Reverse Transcription 10×Buffer、0.5μL RNasin Inhibitor、15μL AMV Reverse Transcriptase（0.65 μg／μL）、4μL Mgcl2（25 mM），加上Nuclear-Free Water至20μL；⑤在PCR儀上反轉錄，條件如下：30℃10min，42℃15min，95℃5min，4℃forever，終止反應，得到cDNA，于-20℃冰箱凍存。

1.2.5 PCR擴增 20μL PCR反應體系包括：上下游引物各0.5μL、2μL cDNA模板、2×Taq PCR Master Mix 10μL、DEPC水7μL，依次加入上述PCR試劑到相應PCR管中，于PCR儀上擴增目的基因。PCR反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性60 s，退火60 s（各基因相對應的退火溫度見表1），72℃延伸30 s，72℃再次延伸5 min，共35個循環(huán)。

1.2.6 凝膠電泳分析及切膠回收 取5μL PCR擴增產品與1μL上樣緩沖液混合均勻，于2%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE電泳緩沖液中，105 V／95 mA電泳40 min，在紫外燈下觀察，用凝膠成像儀拍照分析。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明切膠回收分離純化PCR產物，并作為DNA標準品。

1.2.7 FQ-PCR DNA樣本按101～105copies／μL濃度梯度稀釋制作成標準品作為陽性模板，同時以不加模板PCR體系為陰性對照，每個樣本行3次FQ-PCR反應平行重復實驗。反應體系20μL：熒光染料SYBRGreenI 10μL，上下游引物各0.5μL，模板2μL，補水至20μL。反應條件：95℃3 min，95℃10 s，退火30 s（各基因所對應的退火溫度見表1），65～95℃10 s，共35次循環(huán)。由FQ-PCR儀自動繪制擴增曲線及熔解曲線，產物通過熔解曲線證實。反應結束后，標準曲線由PCR儀附帶的軟件進行分析并自動生成。用得到的標準曲線，將EgB處理組（n=10）和對照組（n=10）小鼠樣本，按上述的反應體系及反應條件進行FQ-PCR。反應結束后用Biorad IQ5 System數據分析軟件進行分析，為消除提取標本、反轉錄和FQ-PCR的差異，以同一標本IL-2／β-actin比值及IL-4／β-actin比值作為評價IL-2、IL-4mRNA表達水平指標。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Excel表格錄入所有數據，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，定量資料兩組均數的比較采用獨立樣本t檢驗分析，檢驗水準（α=0.05）。

2 結果

2.1 PCR擴增產物的鑒定 IL-2、IL-4及β-actin目的片段未見非特異型擴增，電泳鑒定結果見圖1。

2.2 線性范圍與特異性 10倍稀釋的IL-2 mRNA標準品線性范圍為101～105copies／μL，擴增效率為107.7%，相關系數R2=0.908；IL-4 mRNA標準品線性范圍為101～105copies／μL，擴增效率為93.2%，相關系數R2=0.912；β-actin標準品線性范圍為101～105copies／μL，擴增效率為93.9%，相關系數R2=0.922；提示管家基因β-actin與目標基因IL-2、IL-4可以在寬廣范圍內進行準確定量。溶解曲線均顯示單一峰形，提示反應特異性好，符合標準品制備的要求；空白對照反應未檢測出目的片段熒光信號，表明反應體系無污染。

2.3 FQ-PCR檢測結果 用FQ-PCR檢測目地基因表達，IL-2 mRNA在EgB處理組表達量顯著低于對照組中的表達量（P＜0.05）；IL-4 mRNA在EgB處理組表達量顯著高于對照組中的表達量（P＜0.05），見表2。

表2 EgB對STZ誘導的T1DM模型小鼠牙齦IL-2mRNA、IL-4 mRNA表達的調節(jié)作用（±s，copy number／g）

表2 EgB對STZ誘導的T1DM模型小鼠牙齦IL-2mRNA、IL-4 mRNA表達的調節(jié)作用（±s，copy number／g）

注：與對照組比較，aP＜0.05

3 討論

研究［6-7］證實，調節(jié)性T細胞的功能、數量和效應性T細胞與調節(jié)性T細胞的比例失調與T1DM的發(fā)生密切相關，CD4＋Th1細胞過度激活與CD8＋T細胞缺陷在T1DM病理改變中起重要作用［8］。T淋巴細胞是機體重要的免疫細胞群，在維持機體正常免疫功能和保護機體免受各種病原體感染方面起重要作用［9］，按照細胞表面分化群（CD）不同，T淋巴細胞可分為CD4＋和CD8＋兩個亞群，分別介導細胞免疫和體液免疫應答。生理狀態(tài)下，CD8＋T細胞能抑制CD4＋T細胞的增殖，在免疫耐受的維持中具有重要作用［10］。糖尿病狀態(tài)下，抑制性CD8＋T細胞減少、失活，使免疫調節(jié)失控，促進CD4＋細胞對胰島β細胞的免疫損傷，加速糖尿病發(fā)生發(fā)展。Th1／Th2細胞是初始型CD4＋T細胞，即CD4＋T輔助性前體細胞，為在抗原刺激和多種信號傳遞綜合作用下發(fā)生功能性分化的結果［11］。通常情況下，Th1、Th2細胞彼此調節(jié)相互抑制，處于動態(tài)平衡狀態(tài)。異常生理狀態(tài)下，Th0細胞分化功能障礙引起Th1／Th2細胞亞群失衡，表現為相應的飄移性Th1或Th2疾病。IL-2、TNF-α和INF-γ主要由Th1產生，正向調節(jié)細胞免疫應答；IL-13、IL-10、IL-5和IL-4等主要由Th2型細胞產生，促進體液免疫應答［12］。IL-2和IL-4分別是Th1、Th2細胞特征性細胞因子，其分泌水平的變化基本上代表了Th1／Th2細胞分化方向。細胞因子失衡導致免疫調節(jié)紊亂是T1DM發(fā)病的關鍵作用機制，主要包括Th1型細胞因子過度分泌和Th2型細胞因子分泌減少，多試驗結果提示，在全身多個臟器組織中均可發(fā)現上述細胞因子表達水平異常。有研究顯示，EgB可使外周單個核細胞產生Th1／Th2細胞因子比值改變，傾向于病理免疫相關的Th2；可使健康者外周血CD4＋數量降低，CD8＋數量增多，向Th2轉變［13］。

本研究采用EgB處理STZ誘導建立的T1DM小鼠模型，以β-actin基因作內參照，經FQ-PCR檢測IL-2、IL-4mRNA在EgB處理組與對照組表達的絕對差異，通過細胞因子表達的改變推斷EgB對T1DM牙齦組織免疫調節(jié)功能產生的影響。研究結果顯示：EgB處理牙齦組織IL-2 mRNA表達量較對照組明顯下降；而EgB處理牙齦組織IL-4 mRNA表達量較對照組明顯上調。IL-2又稱T細胞生長因子，主要由CD4＋T細胞產生，位居免疫調節(jié)的中心地位，其表達水平可反映患者CD4＋T細胞數量和活性異常，目前對于IL-2在T1DM發(fā)病中的作用說法不一。對NOD小鼠研究發(fā)現，不僅有IL-4表達缺陷同時有IL-2分泌水平低下，與患者外周血細胞培養(yǎng)上清液中IL-2水平低下相一致。同時有大量研究表明，T1DM患者或發(fā)病動物血清中IL-2水平顯著高于正常水平。本研究結果證實EgB可能抑制了T1DM病程中發(fā)生的Th1細胞型反應，從而下調IL-2mRNA在牙齦組織的表達，這與Nicoletti設計的非免疫源性可溶性IFN-γ受體，能使IL-2水平下降，從而預防T1DM的發(fā)生［14］結果相似。但對于IL-2在糖尿病患者或患病動物牙齦組織中表達水平的有無改變，本人尚未搜索到相關研究報道，故對于EgB處理可上調IL-2 mRNA在牙齦組織的表達量，是否視為在牙齦組織中體現的保護作用，尚需進一步驗證。IL-4對T1DM的研究發(fā)現，外源性給予IL-4可逆轉NOD小鼠胸腺和T細胞的體外不應答，并在整體水平上阻止NOD小鼠T1DM的發(fā)生，行抗IL-4抗體處理后可完全阻止這種保護作用，證實了IL-4是保護性細胞因子。對2周齡NOD小鼠連續(xù)10周IL-4治療可預防胰島炎及T1DM發(fā)生，提示IL-4保護功能機制可能是通過調節(jié)自身反應性炎癥因子的趨化和促進Th2細胞的增殖實現的［15］。本實驗EgB處理可使IL-4 mRNA在牙齦組織表達明顯上調，提示EgB可能激活了Th2細胞型反應。有研究顯示IL-4質量濃度下降，可致牙周袋進一步加深，提示IL-4是參與牙槽骨吸收破壞的重要細胞因子［16］。綜上，EgB上調IL-4 mRNA在牙齦組織的表達可視為其對T1DM牙齦組織的保護作用。

（本文圖1見插圖3-2）

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Effect of Echinococcus granulosus antigen B on the expression of IL-2 and IL-4 in the gingival tissues of

streptozotocin（STZ）-induced type 1 diabetic mouse model

Hadeliya Jiapaer，Yiliduosi Aihetamofu，Ayifuhan Ahan
（The Third VIPDepartmentof InternalMedicine，the First Affiliated Hospitalof Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China）

ObjectiveTo study the effect of Echinococcus antigen B（EgB）on the expression of IL-2 and IL-4 in the gingival tissues of streptozotocin（STZ）-induced type 1 diabetic mouse model.MethodsA total of 20 ten-week-old female STZ-induced type 1 diabetic mouse were randomly divided into 2 groups，with 10 mouse in each group.Themouse in the treatmentgroup was injected intraperitonealy with EgB（100μg／10g）for5 consecutive days，and themouse in he control group were injected with 0.9%sodium chloride with the same dose.The gingival tissues were collected，and the expression IL-2，IL-4 mRNA was determined by FQ-PCR.Result The levelof IL-2mRNA in the treatment group was significantly lower than thant in the control group（P＜0.05）；The level of IL-4mRNA in the EgB treated group was significantly increased compared with the control group（P＜0.05）.ConclusionThe expression of IL-2 is decreased and the level of IL-4 is increased in the gingival tissues of streptozotocin（STZ）-induced type 1 diabetic mousemodel treated with EgB.

Diabetes Mellitus，Type 1；Gingivitis；Interleukin-2；Interleukin-4；Echinococcus granulosus；Disease Models，Animal

R587.1

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.018

2014-02-18）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金（2010211B21）

哈德麗婭·加帕爾，碩士在讀，Email：kadirya.j＠gmail.com