銅脅迫對農(nóng)田土壤酶活性、細(xì)菌和古菌數(shù)量的影響

王斐，黃益宗，王小玲，高柱，余發(fā)新，徐峰，保瓊莉，胡瑩，喬敏，金姝蘭，黃永春，李季，向猛

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 1000852. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所, 天津3001913. 江西省科學(xué)院生物資源研究所, 南昌 3300964. 上饒師范學(xué)院, 上饒 334000

銅脅迫對農(nóng)田土壤酶活性、細(xì)菌和古菌數(shù)量的影響

王斐1，黃益宗2,*，王小玲3，高柱3，余發(fā)新3，徐峰1，保瓊莉1，胡瑩1，喬敏1，金姝蘭4，黃永春2，李季1，向猛1

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 1000852. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所, 天津3001913. 江西省科學(xué)院生物資源研究所, 南昌 3300964. 上饒師范學(xué)院, 上饒 334000

為了研究銅礦周邊農(nóng)田土壤中不同Cu含量對土壤酶活性、細(xì)菌和古菌基因拷貝數(shù)的影響，在銅礦周邊農(nóng)田土壤中采集了8個(gè)不同Cu含量的土壤，測定土壤的酶活性、細(xì)菌和古菌基因拷貝數(shù)，結(jié)果表明，土壤總Cu含量為28.30～1 019.27 mg·kg-1，酸可提取態(tài)Cu含量為3.35～415.11 mg·kg-1，細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)在每克干土3.10×1010～1.84×1011個(gè)之間，古菌16S rRNA基因拷貝數(shù)在每克干土7.37×108～6.82×109個(gè)之間。土壤總Cu和酸可提取態(tài)Cu含量對土壤脲酶活性影響較大，但對土壤脫氫酶和轉(zhuǎn)化酶活性影響不顯著。土壤細(xì)菌基因拷貝數(shù)均與總Cu含量、各形態(tài)Cu含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，同樣土壤古菌基因拷貝數(shù)與總Cu含量、各形態(tài)Cu含量也均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明Cu脅迫對土壤細(xì)菌和古菌活性具有較大的抑制作用。

real-time PCR；銅；細(xì)菌；古菌；脲酶；脫氫酶；轉(zhuǎn)化酶

世界礦產(chǎn)資源年評(píng)報(bào)道，我國Cu儲(chǔ)量占全球儲(chǔ)量的4%，居世界第6位，隨著工業(yè)的發(fā)展，在2010年，我國對銅礦的需求占到了全球的41%[1-2]。Cu需求量的增加使銅礦的開采和冶煉活動(dòng)不斷加強(qiáng)，導(dǎo)致大量的Cu進(jìn)入到礦區(qū)周邊的農(nóng)田土壤，給土壤的生態(tài)平衡帶來了巨大的破壞。Cu是生物所需的微量元素，但作為毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，過量的Cu會(huì)對植物的正常生長造成負(fù)面的影響，比如會(huì)造成植物根的褐化、降低植物葉片的酶活性等[3-4]。土壤酶來自于植物和土壤微生物，且可以將大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)而為植物和微生物所用，因此土壤酶是參與土壤中物質(zhì)能量代謝的重要物質(zhì)，有學(xué)者將土壤酶作為重要指示物來反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化[5]。由于脲酶對重金屬非常敏感，人們常把脲酶作為監(jiān)測土壤重金屬污染狀況的指示物[6-7]。Cu污染可以對土壤微生物的生長和繁殖產(chǎn)生較大的影響[8-10]，一定濃度范圍的Cu可造成土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變[11-12]。細(xì)菌和古菌是土壤中廣泛存在的微生物，其種群數(shù)量可以直觀地反映出土壤環(huán)境的變化，尤其是細(xì)菌數(shù)量常被用來反映生態(tài)系統(tǒng)整體是否穩(wěn)定的指標(biāo)之一[13-14]。

礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤中不同Cu含量對土壤酶活性和微生物活性的影響報(bào)道較少，尤其是對古菌活性的影響還未見報(bào)道。本文在礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤中采集不同Cu含量的土壤，主要研究土壤中的細(xì)菌和古菌對Cu長期脅迫的響應(yīng)，利用Real-time PCR技術(shù)分析土壤中細(xì)菌和古菌的基因拷貝數(shù)與受Cu長期脅迫的土壤中Cu全量、各形態(tài)Cu含量的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)研究Cu脅迫對土壤酶活性的影響，以期為Cu污染土壤監(jiān)測和修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 土壤采集與測定

在江西某銅礦冶煉廠周邊根據(jù)不同Cu污染狀況采集農(nóng)田土壤樣品8個(gè)，每個(gè)土壤樣品由5～8個(gè)蛇形取樣的0～20 cm表層土壤樣品混合而來。土壤樣品裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分在室溫下風(fēng)干，過100目篩后儲(chǔ)存在聚乙烯塑料瓶內(nèi)，進(jìn)行理化性質(zhì)的測定；一部分直接貯存在-80℃冰箱里，以備土壤DNA的提取、細(xì)菌和古菌定量PCR的測定。土壤基本理化性質(zhì)及土壤酶活性參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》進(jìn)行分析測定[15]，其中，總Cu含量采用王水-高氯酸法進(jìn)行消解后用ICP-OES和ICP-MS進(jìn)行測定；pH值采用水土比2.5：1法處理后用DELTA 320 pH儀進(jìn)行測定。土壤CEC(陽離子交換量)采用乙酸銨法、有機(jī)質(zhì)采用低溫外熱重鉻酸鉀比色法、土壤總碳、總氮、總硫和碳氮比采用元素分析儀(Vario ELIII, Elementar company, Germany )進(jìn)行測定。土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 土壤Cu的形態(tài)提取方法

采用Rauret等[16]改進(jìn)的BCR分級(jí)提取法提取土壤中Cu的化學(xué)形態(tài)。將Cu分級(jí)提取的各形態(tài)含量與總量相比計(jì)算回收率，Cu的回收率在95%～110%之間，BCR具體提取步驟見表2。

表1 土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 The basic properties of the soil samples

表2 BCR提取步驟Table 2 Sequential extraction procedure of BCR

1.3 土壤DNA的提取和測定

土壤樣品均采用FastDNA SPIN Kit(Bio 101, Inc., USA)試劑盒提取其總DNA，提取過程按試劑盒說明書進(jìn)行。待土壤總DNA提取完成后，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳配合marker檢驗(yàn)DNA的片段大小，并用ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop)分析儀器測定所提取DNA的濃度和OD260/OD280值，保證所提取DNA的質(zhì)量。

土壤中細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因，所用引物由英濰捷基(上海)有限公司合成，引物詳情及其反應(yīng)條件見表3。用Eppendorf PCR儀進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索基因的反應(yīng)條件和體系。Real time PCR反應(yīng)在型號(hào)為iQ5(Bio-Rad, USA)定量PCR儀上運(yùn)行，以測定土壤中細(xì)菌和古菌的基因拷貝數(shù)。細(xì)菌的基因擴(kuò)增反應(yīng)使用TaKaRa公司的PremixExTagTM(Probe qPCR) 試劑盒，古菌的基因擴(kuò)增反應(yīng)采用TaKaRa公司SYBR?PremixExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行。

1.4 定量所用標(biāo)準(zhǔn)曲線

用于細(xì)菌和古菌基因定量的標(biāo)線分別采用供試土壤樣品的克隆子。具體的方法是：(1)提取土壤總DNA(Fast DNA?SPIN Kit for soil)；(2)以土壤DNA為模板，應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)片段；(3)所得PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后連接在pGEM-T Easy載體(Promega, Corp., Madison, Wis., USA)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa)中，篩選獲取的白色菌斑采用T7/SP6通用引物鑒定陽性克隆值并測序驗(yàn)證；(4)陽性克隆子在LB+Ampicillin(氨芐

青霉素)培養(yǎng)基上27℃過夜培養(yǎng)，采用MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒(TaKaRa)提取質(zhì)粒DNA，并用Nanodrop測定其濃度；(5)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品一起擴(kuò)增，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以基因拷貝數(shù)每克干土為單位進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中定量所得數(shù)據(jù)分析利用iCyclery軟件(Version 1.0.1384.0 CR)進(jìn)行，土壤中細(xì)菌和古菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)可分別從基因拷貝數(shù)變化反映出來。采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA(單因素方差分析)及相關(guān)性分析。繪圖采用Sigma Plot 12.5完成。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同樣點(diǎn)土壤Cu的賦存形態(tài)

樣品3～樣品8的Cu的總量均超出了國家土壤環(huán)境質(zhì)量二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17]。采用改進(jìn)的BCR法提取的各土壤樣品的Cu的含量見表4，從表中可以看出，不同樣品Cu的各提取態(tài)含量及百分比差異較大，同時(shí)Cu總量較大的樣品其酸可提取態(tài)Cu含量也較多。樣品3-樣品8的酸可提取態(tài)Cu含量較大而樣品1和樣品2的酸可提取態(tài)Cu含量較小，這是因?yàn)闃悠?-樣品8采自靠近銅冶煉廠周邊的農(nóng)田，該土壤受到了Cu的嚴(yán)重污染。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中使用的引物及PCR條件Table 3 Primers and PCR conditions used in the real-time PCR

表4 土壤樣品中Cu的形態(tài)含量及其百分比Table 4 The concentration of extractable Cu by BCR and the fractionation of Cu in different soils

表5 土壤酶活性、細(xì)菌和古菌基因拷貝數(shù)與總Cu、不同形態(tài)Cu之間的相關(guān)性關(guān)系Table 5 Correlation between the concentrations of Cu and soil enzymes, the gene copies of bacterial and archaea

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在0.01水平上極顯著相關(guān)。

Note: * was used to describe significantly correlated at the 0.05 level, **was used to describe significantly correlated at the 0.01 level.

2.2 不同Cu含量對土壤酶活性的影響

圖1是不同土壤樣品的脲酶活性變化規(guī)律，圖中發(fā)現(xiàn)土壤脲酶活性在8.12～47.08 mg NH3-N·g-1dry soil·d-1范圍之間，樣品2和樣品3的脲酶活性較高，而樣品4-樣品8的脲酶活性較低，它們對應(yīng)的土壤Cu含量也是較高的。對不同土壤樣品的脲酶活性與Cu總量、Cu形態(tài)進(jìn)行相關(guān)分析(表5)，發(fā)現(xiàn)脲酶活性與土壤Cu總量、酸可提取態(tài)Cu含量均呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明Cu脅迫對土壤脲酶活性影響較大。

圖2為不同土壤樣品的脫氫酶活性變化規(guī)律，從圖中看出，土壤脫氫酶活性變化在9.24～29.81 mg TPF·g-1dry soil·d-1范圍之間。樣品2和樣品3的脫氫酶活性最大，樣品5～樣品7脫氫酶活性較小。盡管樣品8的Cu含量最大，但其脫氫酶活性也比較大，僅次于樣品2和樣品3。土壤脲酶活性與Cu總量、Cu各個(gè)形態(tài)相關(guān)性不顯著(表5)，說明Cu脅迫不是影響土壤脫氫酶活性的主要因素。

圖1 不同土壤樣品的脲酶活性變化規(guī)律Fig. 1 Soil urease activity in different samples

圖2 不同土壤樣品的脫氫酶活性變化規(guī)律Fig. 2 Soil dehydrogenase activity in different samples

不同土壤樣品的轉(zhuǎn)化酶活性變化規(guī)律見圖3，從圖中看出轉(zhuǎn)化酶活性在0.37-4.63 mg glucose·g-1dry soil·d-1范圍之間。土壤轉(zhuǎn)化酶活性的變化規(guī)律與脲酶、脫氫酶變化不一致，樣品2和樣品3的轉(zhuǎn)化酶活性最大，樣品6和樣品7的轉(zhuǎn)化酶活性最小。盡管樣品5和樣品8的Cu含量較高，但是其轉(zhuǎn)化酶活性也比較大，Cu含量也不是影響土壤轉(zhuǎn)化酶活性的主要因素。相關(guān)性分析結(jié)果表明(表5)，土壤Cu含量與脫氫酶活性不存在顯著的相關(guān)關(guān)系，因此推斷土壤轉(zhuǎn)化酶活性可能受Cu含量影響較小。

2.3 不同Cu含量對細(xì)菌基因拷貝數(shù)的影響

不同土壤樣品的細(xì)菌基因拷貝數(shù)含量情況見圖4，從圖中看出細(xì)菌基因拷貝數(shù)在每克干土3.10×1010～1.84×1011個(gè)范圍之間。樣品1～樣品3的細(xì)菌基因拷貝數(shù)含量較高，而樣品7、樣品8的細(xì)菌基因拷貝數(shù)含量較低。對不同土壤樣品的細(xì)菌基因拷貝數(shù)與Cu總量、Cu形態(tài)進(jìn)行相關(guān)分析(表5)，結(jié)果顯示，細(xì)菌基因拷貝數(shù)與土壤Cu總量呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.92(p<0.0001)；細(xì)菌基因拷貝數(shù)與土壤酸可提取態(tài)Cu含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.90(p<0.001)；細(xì)菌基因拷貝數(shù)與土壤Fe-Mn氧化物結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu和殘?jiān)鼞B(tài)Cu含量也均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這表明，Cu脅迫對土壤細(xì)菌活動(dòng)具有較大抑制作用。

圖3 不同土壤樣品的轉(zhuǎn)化酶活性變化規(guī)律Fig. 3 Soil invertase activity in different samples

圖4 不同土壤樣品的細(xì)菌基因拷貝數(shù)變化規(guī)律Fig. 4 The quantification of 16S rRNA gene copies of bacteria in different soils

2.4 不同Cu含量對古菌基因拷貝數(shù)的影響

不同土壤樣品的古菌基因拷貝數(shù)含量見圖5，圖中所示古菌基因拷貝數(shù)在每克干土7.37×108～6.82×109個(gè)之間。不同土壤樣品古菌基因拷貝數(shù)的變化規(guī)律與細(xì)菌基因拷貝數(shù)變化相一致，即在Cu含量較高的土壤樣品中古菌基因拷貝數(shù)較少，反之則較多。利用SPSS軟件對古菌基因拷貝數(shù)和土壤Cu總量、Cu形態(tài)含量進(jìn)行相關(guān)分析(表5)，發(fā)現(xiàn)土壤古菌基因拷貝數(shù)與Cu總量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.89(p<0.001)；土壤古菌基因拷貝數(shù)與酸可提取態(tài)Cu含量也呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.89(p<0.001)；古菌基因拷貝數(shù)與土壤Fe-Mn氧化物結(jié)合態(tài)Cu、有機(jī)結(jié)合態(tài)Cu和殘?jiān)鼞B(tài)Cu含量也均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明Cu脅迫對土壤古菌活動(dòng)也有抑制作用。

3 討論(Discussion)

土壤脲酶是與土壤氮循環(huán)相關(guān)的酶，分為胞內(nèi)和胞外兩種，胞內(nèi)脲酶在進(jìn)入土壤后可以迅速地被土壤中的蛋白酶消化，而胞外脲酶由于被固定在土壤固體中因此可以長時(shí)間地發(fā)揮作用[18]。自Rotini在1935年研究了土壤脲酶活性之后，脲酶受到了人們的廣泛關(guān)注[19]。Ge等[20]研究Cu污染土壤中脲酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)土壤總Cu和土壤可溶性Cu均與脲酶呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。我們的結(jié)果與Ge等的結(jié)果相一致。Hu等[21]研究Cu或Se對土壤脲酶的影響，結(jié)果表明，當(dāng)Cu的濃度為200、400和800 mg·kg-1時(shí)，脲酶活性比對照處理分別下降31.5%、38.1%和59.6%。本文的研究結(jié)果表明，當(dāng)Cu的含量為980.14 mg·kg-1時(shí)土壤脲酶活性最低，但是當(dāng)Cu的含量繼續(xù)增加時(shí)，土壤脲酶活性出現(xiàn)了一定的回升，這可能是因?yàn)橥寥李愋图爸車h(huán)境對脲酶活性影響較大。土壤脫氫酶常被用作土壤環(huán)境變化的指示性物質(zhì)。Bartowiak和Lemanowicz以磷酸酶和脫氫酶作為快速指示物來探討重金屬對烏尼斯瓦夫盆地土壤質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)土壤中Zn含量對脫氫酶有顯著影響，原因可能是Zn作為酶的重要組成部分，在一定范圍內(nèi)可以促進(jìn)酶的活性，但超過一定的閾值后又會(huì)顯著地抑制酶的活性[22-23]。本研究中，脫氫酶活性并沒有和土壤中的Cu含量呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)關(guān)系，但是在一些土壤樣品中Cu顯著地抑制了脫氫酶的活性。土壤轉(zhuǎn)化酶與土壤碳循環(huán)相關(guān)，是一種水解酶，其可以將土壤中高分子量的蔗糖水解成小分子而被生物所利用[24]。因此，轉(zhuǎn)化酶活性的大小可以反映出土壤中有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化規(guī)律。本研究中，土壤轉(zhuǎn)化酶活性和Cu含量無顯著的相關(guān)性，但在一些土壤樣品中Cu顯著地抑制了轉(zhuǎn)化酶的活性。

圖5 不同土壤樣品的古菌基因拷貝數(shù)變化規(guī)律Fig. 5 The quantification of 16S rRNA gene copies of Archaea in different soils

微生物在土壤新陳代謝和土壤結(jié)構(gòu)的維持中起著重要的作用，微生物的種群和數(shù)量可以指示土壤的質(zhì)量且微生物數(shù)量的改變是最簡單、最直接的反映土壤質(zhì)量變化的指標(biāo)。重金屬含量對土壤微生物數(shù)量有一定的影響。細(xì)菌是土壤系統(tǒng)中廣泛存在且所占比例較高的微生物，所以，很多學(xué)者通過研究細(xì)菌群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化來反映土壤的質(zhì)量[25]。Li等[26]研究了不同Cu濃度(0、50、100、200、400、800、1 600和3 200 mg·kg-1)的短期或長期暴露對細(xì)菌種群數(shù)量變化的影響，結(jié)果表明，在短期暴露實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌基因拷貝數(shù)呈整體下降趨勢，而在長時(shí)間Cu的脅迫下，細(xì)菌表現(xiàn)出對環(huán)境(3 200 mg·kg-1)的適應(yīng)性，細(xì)菌基因拷貝數(shù)呈現(xiàn)出增長趨勢。本研究所采集土樣已長期受到周邊冶煉廠Cu污染的影響，細(xì)菌受Cu脅迫的影響結(jié)果趨于穩(wěn)定，即細(xì)菌基因拷貝數(shù)隨Cu總量的增加而減少。Chen等利用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)研究了提取態(tài)Cu含量和細(xì)菌多樣性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多樣性與提取Cu含量在一定范圍內(nèi)呈顯著的負(fù)相關(guān)[27]。本研究利用BCR法對土壤中Cu的不同形態(tài)進(jìn)行了提取，發(fā)現(xiàn)土壤酸可提取態(tài)Cu含量與細(xì)菌基因拷貝數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)，這與Chen等的研究結(jié)果相一致。Brajesh等[28]利用焦磷酸測序和T-RFLP(Terminal-restriction fragment length polymorphism)方法對重金屬污染土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫不僅改變了土壤中微生物的數(shù)量，也改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為明顯的多樣性降低。微生物群落結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化，而基因拷貝數(shù)僅僅從表面上反映了受脅迫后土壤微生物的響應(yīng)，因此，群落結(jié)構(gòu)變化應(yīng)作為今后土壤微生物受脅迫響應(yīng)的研究重點(diǎn)，以此來了解核心微生物或功能微生物群體[28]。本文只從細(xì)菌基因拷貝數(shù)的變化來研究土壤Cu脅迫的影響，今后還需借助T-RFLP或DGGE技術(shù)來研究哪一類細(xì)菌或功能微生物受到土壤Cu脅迫的影響。

土壤中的古菌在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用：產(chǎn)甲烷古菌可通過影響厭氧過程來影響碳的循環(huán)，而氨氧化古菌可通過硝化作用來影響氮的循環(huán)。Tarah等[29]報(bào)道，古菌的群落組成與土壤提取態(tài)Cu含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.61，p<0.001)，而我們的結(jié)果與其相反，古菌基因拷貝數(shù)與土壤Cu總量、酸可提取態(tài)Cu含量均呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Xia等的研究也表明，可利用態(tài)Cu含量的增加將明顯地降低土壤氨氧化古菌的基因拷貝數(shù)，這是由于Cu2+、H+、及其它離子對土壤硝化過程的抑制而造成的[8]。Orell等研究Cu對古菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)Sulfolobusmetallicus(金屬硫化葉菌)和Ferroplasmaacidarmanus(嗜酸乳桿菌)均表現(xiàn)出對高濃度Cu(312 mmol·L-1)的適應(yīng)性。Besaury等的研究表明，Cu雖然降低了古菌群落的豐度，但卻提高了它們的活性[30]，這是因?yàn)镃u濃度的增加誘導(dǎo)了古菌的一些抗氧化基因的表達(dá)[31]。為了更加深入地了解Cu脅迫對土壤古菌群落的影響，有必要利用最新的分子生物學(xué)手段來確定Cu脅迫下的古菌優(yōu)勢種群，以期為Cu污染土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

綜上所述，Cu脅迫顯著地抑制土壤脲酶活性，對土壤脫氫酶和轉(zhuǎn)化酶活性也有一定的影響。土壤細(xì)菌基因拷貝數(shù)與Cu總量、酸可提取態(tài)Cu含量均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，同樣土壤古菌基因拷貝數(shù)與Cu總量、酸可提取態(tài)Cu含量也呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明Cu脅迫對土壤細(xì)菌、古菌活動(dòng)均有明顯的抑制作用。

[1] 王 威, 李以科, 封 寧. 全球銅礦資源格局分析[J]. 資源與產(chǎn)業(yè), 2013, 5: 27-32

Wang W, Li Y K, Feng N. Global cooper resource pattern [J]. Resources and Industires, 2013, 15(5): 27-32

[2] 張 波, 管靜怡, 李 孟. 中國銅礦企業(yè)對外投資現(xiàn)狀、風(fēng)險(xiǎn)因素與策略選擇[J]. 對外經(jīng)貿(mào)實(shí), 2013, 3: 81-84

Zhang B, Guan J Y, Li M. Status of foreign investment, risk factors and strategies for Chinese copper enterprise [J]. Practice in Foreign Economic Relations and Trade, 2013, 3: 81-84 (in Chinese)

[3] Harmanescu M, Alda L M, Bordean D M, et al. Heavy metals health risk assessment for population via consumption of vegetables grown in old mining area; a case study: Banat County, Romania [J]. Chemistry Central Journal, 2011, 5(1): 1-10

[4] Guo P, Wang T, Liu Y, et al. Phytostabilization potential of evening primrose (Oenotheraglazioviana) for copper-contaminated sites [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2014, 21(1): 631-640

[5] Zhan J, Sun Q. Development of microbial properties and enzyme activities in copper mine wasteland during natural restoration [J]. CATENA, 2014, 116: 86-94

[6] Ramesh R, Aarthy M, Gowthaman M K, et al. Screening and production of a potent extracellular Arthrobacter creatinolyticus urease for determination of heavy metal ions. Journal of Basic Microbiology, 2014, 54(4): 285-295

[7] Wang Y P, Shi J Y, Wang H, et al. The influence of soil heavy metals pollution on soil microbial biomass, enzyme activity, and community composition near a copper smelter. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2007, 67(1): 75-81

[8] Li X, Zhu Y G, Cavagnaro T R, et al. Do ammonia-oxidizing archaea respond to soil Cu contamination similarly asammonia-oxidizing bacteria? [J]. Plant and Soil, 2009, 324(1-2): 209-217

[9] Kunito T, Nagaoka K, Tada N, et al. Characterization of Cu-resistant bacterial communities in Cu-contaminated soils [J]. Soil science and plant nutrition, 1997, 43(3): 709-717

[10] Li X F, Yin H B, Su J Q. An attempt to quantify Cu-resistant microorganisms in a paddy soil from Jiaxing, China [J]. Pedosphere, 2012, 22(2): 201-205

[11] Wakelin S A, Chu G, Lardner R, et al. A single application of Cu to field soil has long-term effects on bacterial community structure, diversity, and soil processes [J]. Pedobiologia, 2010, 53(2): 149-158

[12] Kimball B E. Biogeochemical cycling of copper in acid mine drainage [D]. The Pennsylvania State University, 2009

[13] Ghosh S, Moitra M, Woolverton C J, et al. Effects of remediation on the bacterial community of an acid mine drainage impacted stream [J]. Canadian journal of microbiology, 2012, 58(11): 1316-1326

[14] Zhan J, Sun Q. Development of microbial properties and enzyme activities in copper mine wasteland during natural restoration [J]. CATENA, 2014, 116: 86-94

[15] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000

Lu R K. Methods for Soils Agricultural Chemical Analysis [M]. Beijing: Chinese Agricultural Science and Technology Press, 2000 (in Chinese)

[16] Rauret G, López-Sánchez J F, Sahuquillo A, et al. Application of a modified BCR sequential extraction (three-step) procedure for the determination of extractable trace metal contents in a sewage sludge amended soil reference material (CRM 483), complemented by a three-year stability study of acetic acid and EDTA extractable metal content [J]. Journal of Environmental Monitoring, 2000, 2(3): 228-233

[17] G B 15618-1995. 土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S]. 1995

GB 15618-1995. Environmental Quality Standard for Soils [S]. 1995 (in Chinese).

[18] Ramesh R, Aarthy M, Gowthaman M K, et al. Screening and production of a potent extracellular Arthrobacter creatinolyticus urease for determination of heavy metal ions [J]. Journal of basic microbiology, 2013

[19] Makoi J H J R, Ndakidemi P A. Selected soil enzymes: Examples of their potential roles in the ecosystem [J]. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(3): 181-191

[20] Ge C R, Zhang Q C. Microbial community structure and enzyme activities in a sequence of copper-polluted soils [J]. Pedosphere, 2011, 21(2): 164-169.

[21] Hu B, Liang D, Liu J, et al. Ecotoxicological effects of copper and selenium combined pollution on soil enzyme activities in planted and unplanted soils [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2013, 32(5): 1109-1116

[22] Bartkowiak A, Lemanowicz J. Application of biochemical tests to evaluate the pollution of the Unislaw basin soils with heavy metals [J]. International Journal of Environmental Research, 2014, 8(1): 93-100

[23] Arriagada C, Almonacid L, Cornejo P, et al. Influence of an organic amendment comprising saprophytic and mycorrhizal fungi on soil quality and growth of Eucalyptusglobulusin the presence of sewage sludge contaminated with aluminium [J]. Archives of Agronomy and Soil Science, 2013, 60(9): 1229-1248

[24] Song Y, Song C, Tao B, et al. Short-term responses of soil enzyme activities and carbon mineralization to added nitrogen and litter in a freshwater marsh of Northeast China [J]. European Journal of Soil Biology, 2014, 61: 72-79

[25] Behera B C, Mishra R R, Patra J K, et al. Impact of heavy metals on bacterial communities from mangrove soils of the Mahanadi Delta (India) [J]. Chemistry and Ecology, 2013, 29(7): 604-619

[26] Li J, Zheng Y M, Liu Y R, et al. Initial copper stress strengthens the resistance of soil microorganisms to a subsequent copper stress [J]. Microbial Ecology, 2014, 67(4): 931-941

[27] Chen Y X, Wang Y P, Wu W X, et al. Impacts of chelate-assisted phytoremediation on microbial community composition in the rhizosphere of a copper accumulator and non-accumulator [J]. Science of the Total Environment, 2006, 356(1): 247-255

[28] Singh B K, Quince C, Macdonald C A, et al. Loss of microbial diversity in soils is coincident with reductions in some specialized functions [J]. Environmental Microbiology. doi: 10.1111/1462-2920.12353.

[29] Sullivan T S, McBride M B, Thies J E. Soil bacterial and archaeal community composition reflects high spatial heterogeneity of pH, bioavailable Zn, and Cu in a metalliferous peat soil [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 66: 102-109

[30] Besaury L, Ghiglione J F, Quillet L. Abundance, activity, and diversity of archaeal and bacterial communities in both uncontaminated and highly copper-contaminated marine sediments [J]. Marine Biotechnology, 2013: 1-13

[31] Orell A, Navarro C A, Arancibia R, et al. Life in blue: Copper resistance mechanisms of bacteria and archaea used in industrial biomining of minerals [J]. Biotechnology Advances, 2010, 28(6): 839-848

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EffectsofCuStressonEnzymeActivity,BacteriaandArchaeaQuantityinSoils

Wang Fei1，Huang Yizong2,*，Wang Xiaoling3，Gao Zhu3，Yu Faxin3，Xu Feng1，Bao Qiongli1，Hu Ying1，Qiao Min1，Jin Shulan4，Huang Yongchun2，Li Ji1，Xiang Meng1

1. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China2. Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China3. Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China4. Shangrao Normal University, Shangrao 334000, China

12 May 2014accepted1 July 2014

To study different Cu contents in surrounding soils of a copper smelting on soil enzyme activity, bacterial and archaeal quantity, eight soil samples were collected, and enzyme activity, bacterial and archaeal quantity in soils were determined. The results showed that the concentrations of total Cu and acid extractable Cu were in the ranges of 28.3-1 019.27 mg·kg-1and 3.35-415.11 mg·kg-1, respectively. The ranges of gene copies numbers of bacteria and archaea were 3.10×1010-1.84×1011and 7.37×108-6.82×109copies per gram of dry soil, respectively. The soil urease activity was significantly affected by total Cu and acid extractable Cu in soils, while soil dehyrogenase and incertase activity were not affected by them. There was significant negative relationship between gene copies of bacteria (or archaea) and total Cu (or different forms Cu), suggesting that the activities of bacteria and archaea could be inhibited by Cu stress.

real-time PCR; copper; bacteria; archaea; urease; dehydrogenase; invertase

2014-05-12錄用日期：2014-07-01

1673-5897(2014)4-707-08

： X171.5

： A

黃益宗(1970—)，男，博士，研究員，主要從事重金屬在土壤-植物系統(tǒng)中的遷移、轉(zhuǎn)化和積累研究，以及污染土壤修復(fù)技術(shù)、污染生態(tài)學(xué)等方面的研究，近年來在國內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文130多篇。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21377152)和江西省科學(xué)院省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(2012-KLB-1和2013-KLB-08)資助

王斐(1988-)，女，碩士，研究方向?yàn)橥寥郎鷳B(tài)學(xué)，E-mail: xiaofeilx.2008@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: hyz@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140512002

王 斐，黃益宗，王小玲, 等. 銅脅迫對農(nóng)田土壤酶活性、細(xì)菌和古菌數(shù)量的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9(4): 707-714

Wang F, Huang Y Z, Wang X, et al. Effects of Cu stress on enzyme activity, bacteria and Archaea quantity in soils [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 707-714 (in Chinese)