紫杉醇對兔耳增生性瘢痕的作用

黃麗萍，王興林，張 冷，畢 勝，林碧文解放軍總醫院，北京 00853；大連市中醫醫院，遼寧大連 603

紫杉醇對兔耳增生性瘢痕的作用

黃麗萍1，王興林1，張 冷2，畢 勝1，林碧文1
1解放軍總醫院，北京 100853；2大連市中醫醫院，遼寧大連 116032

目的觀察藥物紫杉醇對兔耳增生性瘢痕的作用。方法 在兔耳腹側面建立增生性瘢痕模型，將紫杉醇藥品配制成濃度為12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、96 mg/L；18 mg/L、54 mg/L、162 mg/L、486 mg/L；30 mg/L、150 mg/L、750 mg/L、3 750 mg/L的藥液，觀察不同濃度的藥物對兔耳增生性瘢痕的作用，尋找療效最佳的藥物濃度。結果在48 ～ 162 mg/L濃度范圍內，兔耳瘢痕增生指數隨藥物濃度的增加而減少。結論紫衫醇對兔耳增生性瘢痕的成纖維細胞增殖、膠原沉積、微血管增生均有抑制作用。

增生性瘢痕；紫杉醇；模型，動物

病理性瘢痕的形成，與傷口愈合過程中皮膚成纖維細胞大量增殖與凋亡障礙、細胞外基質合成與降解失衡、細胞因子調節機制紊亂、組織微血管過度增生等因素密切相關[1-2]。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取的一種具有抗癌、抗微管增生作用的藥物，有研究表明紫杉醇可以抑制成纖維細胞的增殖以及血管的形成[3]。我們將不同濃度的紫杉醇藥液以瘢痕內注射的形式作用于兔耳瘢痕模型上，觀察紫杉醇對瘢痕組織的作用，驗證藥物療效、摸索藥物應用的最佳濃度范圍。

材料和方法

1 材料 紫杉醇注射液(生產廠家：Corden Pharma Latina S.P.A；規格：5 ml：30 mg；進口藥品注冊證號H20110470)，蘇木素-伊紅、天狼猩紅染液、酸性品紅液、苯胺藍液。日本大耳白兔18只，兔耳健全，體質量2.0 ～ 2.5 kg。

2 增生性瘢痕動物模型的建立 將動物麻醉后，兔耳腹側面去毛，消毒鋪洞巾，避開血管，于每只兔耳腹側面中線兩側分別做4個1.5 cm×1.5 cm方形全層皮膚缺損創面，用手術刀刮除軟骨膜、保留軟骨，36只兔耳共144個創面，制成后創面包扎，術后第2天摘除敷料，暴露創面，待其自然愈合。見圖1。

3 藥物配制 紫杉醇注射液(濃度為6 000 mg/L)，以注射用水稀釋，以6 mg/L為基礎濃度，按2倍、3倍和5倍濃度梯度遞增，分別配制成濃度為12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、96 mg/L；18 mg/L、54 mg/L、162 mg/L、486 mg/L；30 mg/L、150 mg/L、750 mg/L、3 750 mg/L的藥液。

4 藥物注射與取材 每只兔子兩耳共8個瘢痕組織塊，于造模術后28 d兔耳瘢痕生長最高峰時，取1個組織塊作為空白對照，僅注射注射用水，1個注射基礎濃度6 mg/L的藥液，其余6個瘢痕組織塊按濃度梯度遞增，分別被注射6個不同濃度的藥液。給藥方法：以1 ml注射器從兔耳瘢痕邊緣基底部選取3 ～ 5個進針點，以瘢痕灶中心為進針方向，在針體行進過程中逐步推針管給藥，注射完畢后局部壓迫1 ～ 2 min以防藥液從針孔滲漏。每個瘢痕塊注射藥液總量為0.8 ml。用藥后10 d取材，中性甲醛固定48 h，石蠟包埋。

5 測定瘢痕增生指數(hypertrophic index，HI) HE染色切片低倍鏡下用顯微測量尺測量，按公式：HI=A/B計算瘢痕增生指數[4]。見圖2。

圖 1 兔耳瘢痕造模手術示意圖Fig. 1 Rabbit ear scar operation model

圖 2 瘢痕增生指數(HI)計算示意圖： 瘢痕最高點至軟骨表面的垂直厚度(A)，正常皮膚至軟骨表面的垂直厚度(B)，兔耳軟骨(C)，HI=A/BFig. 2 Calculation of hyperplastic scar index A: The vertical thickness from the top of scar to the cartilage surface; B: The vertical thickness from the normal skin to cartilage surface;C: The rabbit ear cartilage

6 成纖維細胞密度 HE染色切片，400倍光鏡下用Lumenera Infinity2-1 CDD相機動態觀察并進行矩形視野選擇，在瘢痕厚度最大區域內，于淺部、深部各選擇3個不重疊視野；在瘢痕兩側邊緣各選2個不重疊視野，共10個視野。每個視野按相同的平行網格進行區域劃分，分別統計各網格內的成纖維細胞數求和即為該矩形視野的總成纖維細胞數。10個矩形視野分別計數，結果取均數即為該張切片的成纖維細胞密度。

7 膠原纖維面密度 天狼猩紅染色切片，400倍光鏡下在瘢痕淺部和深部、兩側邊緣部各隨機選取10個視野，應用計算機輔助病理圖像分析系統計算紅染膠原面的密度，結果取均數[5-6]。

8 微血管密度 HE染色切片切片，400倍光鏡下選擇血管密集的區域，計數5個視野內的微血管(管腔＞8個紅細胞直徑的微血管則不計數)，取其平均數即為微血管增生密度。

9 統計學分析 用EXCEL建立數據庫，SPSS16.0統計軟件分析，數據結果以表示。采用單因素方差分析進行差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HE染色 空白對照組：可見瘢痕組織中成纖維細胞數量較多，細胞體積較大，微血管較豐富，可見炎細胞浸潤。瘢痕組織淺層膠原纖維致密，排列紊亂，多為Ⅰ型膠原纖維。深層膠原纖維呈線條狀排列，無規律，膠原纖維較淺層長(圖3A)；紫杉醇治療組(濃度162 mg/L)：成纖維細胞數量較治療前減少，膠原疏松呈線條狀排列，微血管較用藥前稀疏(圖3B)。

2 天狼猩紅染色 空白對照組：瘢痕組織內膠原纖維呈不規則的纖維網狀條索，分布密集，纖維較粗大(圖4A)；紫杉醇治療組：瘢痕組織內膠原纖維排列較規則，較空白對照組稀疏，纖維較纖細 (圖 4B)。

圖 3 HE染色下空白對照組(A)與治療組(B)的瘢痕組織成纖維細胞、膠原及血管(×200)Fig. 3 HE staining (×200) showing fi broblasts, collagen and blood vessels in scar tissue of control group (A) and treatment group (B)

圖 4 天狼猩紅染色下空白對照組(A)與治療組(B)的瘢痕組織膠原示意圖(×400)Fig. 4 Sirius red staining (×400) showing collagen in scar tissue of control group (A) and treatment group (B)

圖 5 三色染色下空白對照組(A)與治療組(B)的瘢痕組織大體觀察及血管、膠原情況(×40)Fig. 5 Masson trichrome staining (×40) showing blood vessels and collagen in scar tissue of control group (A) and treatment group (B)

表1 不同濃度的紫杉醇藥液對兔耳瘢痕增生指數、成纖維細胞、膠原、微血管密度的影響Tab. 1 Effect of paclitaxel at different concentrations on hyperplastic scars, fi broblasts, collagen and micro-vessels of rabbit ear scar

3 三色染色 空白對照組：瘢痕較厚，血管豐富，膠原密集(圖5A)；紫杉醇治療組：瘢痕較平坦，血管減少，膠原密度較對照組低(圖5B)。

4 不同濃度紫杉醇藥液的作用效果 當紫杉醇藥液濃度＞400 mg/L時，兔耳瘢痕組織會出現局部壞死；與空白組比較，藥液濃度為96 mg/L、150 mg/L、162 mg/L時療效顯著。見表1。

討 論

病理性瘢痕的形成是十分復雜的生物學過程，從組織形態上是以成纖維細胞為主的過度增殖，細胞外基質中膠原過量沉積、排列紊亂，且難以被機體吸收或重塑的病理狀態[7-9]。瘢痕的實驗研究一般包括離體細胞培養、動物造模和臨床實驗觀察3種形式[10]。在體外細胞模型中，多為將病理性瘢痕組織中的成纖維細胞體培養、人工傳代后，將各類干預手段作用于細胞[7]。它的局限性在于人工細胞培養的外環境與人體復雜的內環境有較大差異，作用條件單一，在體外細胞模型上得出的實驗結果往往有偏移。將各種治療手段直接作用于病理性瘢痕的病變局部，雖然可以得出較可靠、直接的實驗結果，但實驗的受限條件較多且取材不便。因而許多學者選擇在動物模型上進行治療病理性瘢痕的新療法或藥物的研究。目前較公認的動物模型有裸鼠模型和兔耳瘢痕模型[11-14]。裸鼠模型是將人類瘢痕的組織移植于裸鼠皮膚上進行生長，但由于物種差異較大，移植后因免疫排斥反應等因素，移植的人類瘢痕組織會發生萎縮，影響了實驗結果的可靠性。兔耳瘢痕模型是在瘢痕研究中被較多應用的另一類動物模型，兔耳腹側面缺乏肉膜結構，創面的修復、愈合過程及瘢痕形成后的組織病理學特點與人類瘢痕的形成有許多相似處。因此，在本研究中我們采用了兔耳瘢痕模型作為研究對象，在成功生長于兔耳腹側面的瘢痕組織上以局部注射的方式給藥，并觀察不同藥物濃度對兔耳瘢痕組織的作用，摸索藥物作用的最佳濃度范圍。紫杉醇是已被臨床廣泛應用的抗腫瘤藥物，它通過進入靶細胞與細胞內微管結合，促進微管聚集、阻礙微管正常的生理性解聚，從而使細胞增殖受阻，并誘導細胞凋亡，紫杉醇對膠原合成及成纖維細胞的過度增生均有抑制作用，此外紫杉醇還具有抗微血管增生的作用[15-16]。我們觀察到，在48 ～ 162 mg/L濃度范圍內，兔耳瘢痕增生指數隨藥物濃度的增加而減少。在病理觀察中我們發現，用藥后的兔耳瘢痕組織中，無明顯的炎癥細胞浸潤，成纖維細胞密度降低，部分細胞胞核淡染，呈現凋亡現象；而對照組兔耳瘢痕組織中，炎癥細胞浸潤明顯，成纖維細胞密度較用藥組顯著增高，真皮層中可見大量排列無序、細胞核呈深染狀態的成纖維細胞。進一步驗證了紫杉醇可直接抑制成纖維細胞生長增殖這一結論[17]。在病理性瘢痕的形成中，膠原纖維是組織構成的結構性支架，具有極其重要的作用[18]。在本實驗中我們觀察到，空白對照組的瘢痕組織中，膠原纖維粗大，排列紊亂、屈曲扭結、呈環狀改變；而用藥后的瘢痕組織中，膠原纖維纖細、排列規則有序，密度較空白對照組顯著降低。瘢痕組織的生長需要血管的增殖和架構，紫杉醇因具有抗微血管增生的作用，故可抑制病理性瘢痕組織的形成，經藥物處理后的瘢痕組織血管密度較空白組明顯減小，組織體積較對照組明顯萎縮。在大體目測觀察中我們還發現，在48 ～ 162 mg/L這一濃度范圍內，以注射方式給藥的紫衫醇藥液不但可抑制兔耳瘢痕的增生，而且對瘢痕表皮的破壞較小，無組織潰爛、壞死，作用溫和，是較理想的抗瘢痕藥物[19]。

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Role of paclitaxel in treatment of hyperplastic scars on rabbit ears

HUANG Li-ping1, WANG Xing-lin1, ZHANG Leng2, BI Sheng1, LIN Bi-wen1
1Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Dalian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116032, Liaoning Province, China
Corresponding author: WANG Xing-lin. Email: Wangxingl301@126.com

ObjectiveTo observe the role of paclitaxel in treatment of hyperplastic scars on rabbit ears.MethodsA rabbit ear hyperplastic scar model was established. The role of paclitaxel in treatment of hyperplastic scars on rabbit ears was observed at the concentrations of 12 mg/L, 24 mg/L, 48 mg/L, 96 mg/L, 18 mg/L, 54 mg/L, 162 mg/L, 486 mg/L, 30 mg/L, 150 mg/L, 750 mg/L, and 3 750 mg/L, respectively. Results Paclitaxel at the concentration of 48-162 mg/L reduced the number of hyperplastic scars on rabbit ears.ConclusionPaclitaxel can inhibit the proliferation of fi broblasts, deposition of collagen, and micro-angiogenesis in hyperplastic scars on rabbit ears.

hyperplastic scar; paclitaxel; models, animal

R363

A

2095-5227(2014)05-0485-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.05.024

2013-09-25

解放軍總醫院臨床科研扶持基金(2013FC-TSYS-1027)

黃麗萍，女，博士，主治醫師。研究方向：瘢痕康復、體表射頻消融。Email: ping-online@163.com

王興林，男，碩士，教授，主任醫師。Email: Wangxingl301@126.com