棘白霉素B脫酰基酶產生菌轉化條件的優化研究

關亞鵬，婁 忻，張 莉，劉 靚，佟 杰

（1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊050015；2.華北制藥集團股份有限公司，河北 石家莊050015）

棘白霉素類抗真菌藥是一類最新型的廣譜抗真菌藥，能夠抑制真菌細胞壁的合成，對念珠菌屬和曲霉屬等引起的深部感染均有效，這類藥物抗菌譜廣、毒性低、無交叉耐藥性，對治療嚴重感染具有廣闊的應用前景。目前已上市的該類藥物包括卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈[1－6］。脫酰基酶產生菌可以將米卡芬凈和阿尼芬凈的前體物質FR901379和棘白霉素B脫去酰基側鏈形成母核（中間體），由母核進而合成米卡芬凈或阿尼芬凈。

作者以棘白霉素B為前體物質，研究脫酰基酶產生菌轉化阿尼芬凈中間體的條件，首先利用紫外誘變復合Cu2＋抗性處理篩選脫酰基酶產生菌高產菌種，之后以均勻設計方法對高產菌種的轉化條件進行優化，擬為其工業化應用奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

棘白霉素類化合物脫酰基酶產生菌ZH－1020，自行保存。

固體培養基：葡萄糖，酵母粉，復合維生素B，微量鹽。

種子培養基：糊精，葡萄糖，酵母粉，玉米漿，FeSO4·7H2O，K2HPO4·3H2O。

發酵培養基：酵母粉，熱榨豆餅粉，蔗糖，硫酸鎂，K2HPO4·3H2O，pH 值6.5。

1.2 搖瓶培養

將成熟斜面接種至種子培養基，于28℃、220r·min－1搖床培養48h后，以5%的接種量接入發酵培養基，于28℃、220r·min－1培養4d后補入已知濃度的底物（棘白霉素B）至培養基中底物終濃度為1 800μg·mL－1，繼續轉化48h。轉化結束后利用HPLC法測定發酵液效價，計算轉化率（發酵液效價與底物添加量的比率）。

1.3 菌種誘變與篩選

1.3.1 紫外誘變處理

將供試菌種斜面制得的單孢子懸液置于平板中，紫外燈（30W，254nm，36cm）下照射15s，孢子液逐級稀釋到合適濃度后涂布到固體培養基平板上，28℃下培養8d，進行搖瓶篩選。

1.3.2 紫外誘變復合Cu2＋平板抗性處理

制備含有0.02%、0.04%、0.06%CuSO4的平板培養基，將紫外照射處理過的孢子液適當稀釋后涂布于該平板上，培養8～10d后挑選孢子豐富、菌落相對較大的抗性菌落移至斜面，再進行搖瓶篩選。

1.4 均勻設計實驗

溫度、pH值等外界環境對轉化菌內酶的啟動和表達有著非常重要的影響。設定轉化溫度（℃）、發酵培養基pH 值、底物濃度（μg·mL－1）、轉化時間（h）為自變量X1、X2、X3和X4，相對轉化率為因變量Y1，進行4因素3水平的均勻設計實驗優化脫酰基酶產生菌的轉化條件，各因素及水平見表1 。

表1 U9（34）均勻設計實驗的因素和水平Tab.1 The factors and levels of U9（34）uniform design experiment

2 結果與討論

2.1 搖瓶篩選結果（表2 ）

表2 紫外誘變復合Cu2＋抗性處理結果／%Tab.2 Results of UV irradiation combined with Cu2＋resistance selection／%

由表2 可知，紫外誘變復合Cu2＋抗性處理后的菌株死亡率較單一紫外誘變處理有了一定提高，說明此菌株對Cu2＋比較敏感，且CuSO4劑量為0.04%時，菌株死亡率適中，正突變率也最高，達到25.7%。因此，后續實驗中確定CuSO4劑量為0.04%。

以ZH－1020為出發菌株，經紫外誘變復合0.04%CuSO4抗性處理后，挑選187株抗性菌株進行搖瓶初篩，對轉化率提高一定水平的正突變株進行復篩，得到菌株132＃，經3批實驗驗證，其轉化率較出發菌株提高了22.6%（表3 ）。

2.2 均勻設計實驗結果與分析

對132＃菌株進行轉化條件優化，均勻設計實驗結果見表4。

應用均勻設計V4.0版軟件對結果進行分析，得到 的 回 歸 方 程 為：Y1＝ 54.72 － 0.64 X1X2＋0.0026 X1X3＋3.24－0.013 X2X3＋0.0008 X3X4－0.0099，R2＝0.9906。

表3 132＃菌株搖瓶篩選結果／%Tab.3 Flask fermentation results of strain 132＃／%

表4 均勻設計實驗結果Tab.4 Results of uniform design experiment

回歸方程的方差分析及綜合最優解見表5 和表6。

表5 回歸方程的方差分析Tab.5 The variance analysis of the regression equation

由表5 可知，回歸方程的F 值＞F0.05（6，3）、P 值＜0.05，說明方程擬合良好，具有極其顯著的意義。

表6 綜合最優解Tab.6 The comprehensive optimum solution

由表6可知，優化的轉化條件為：溫度30℃、培養基pH 值6.0、底物濃度2 400μg·mL－1、轉化時間56h。

2.3 驗證實驗

采用上述確定的優化轉化條件進行3批驗證實驗，測定誘變菌株132＃的轉化率，每批實驗取3個樣品的平均值，結果見表7。

表7 驗證實驗結果／%Tab.7 Results of verifying experiment／%

由表7可知，誘變菌株132＃在轉化條件優化后，轉化率又提高了28.3%，較出發菌株在原始轉化條件下提高了57.3%。

3 結論

（1）利用紫外誘變復合Cu2＋抗性處理棘白霉素B脫酰基酶產生菌，篩選得到了高產突變菌株132＃，其轉化率比出發菌株提高了22.6%。表明該菌株對紫外誘變復合Cu2＋抗性處理的誘變方法比較敏感，該方法是一種非常有效的篩選手段。

（2）利用均勻設計方法優化的轉化條件為：溫度30℃、培養基pH值6.0、棘白霉素B濃度2 400μg·mL－1、轉化時間56h，誘變菌株132＃在優化條件下的轉化率又提高了28.3%，相對于出發菌株在原始轉化條件下提高了57.3%，說明在合適的溫度下增加底物濃度并延長轉化時間是提高轉化率的有效途徑。后續研究還可以通過發酵培養基配方優化或嘗試其它誘變方法等進一步提高菌種轉化率。

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