納米四氧化三鐵模擬酶催化光度法測定食品中痕量雙氧水*

劉細(xì)祥，歐陽輝祥，謝宇奇，凌紹明，蘭翠玲

（百色學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西百色 533000）

雙氧水（H2O2）是一種強(qiáng)氧化劑，具有良好的氧化、漂白、防腐和消毒等功能，在食品工業(yè)中，H2O2被廣泛用于加工助劑和奶制品、食品纖維和食品包裝材料的消毒殺菌。毒理學(xué)研究表明，當(dāng)H2O2的濃度達(dá)到0.5 mmol/L時，可自然產(chǎn)生羥基自由基，氧化生物體細(xì)胞，導(dǎo)致疾病和加速衰老，對生物體有害。中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定：H2O2只允許在生鮮牛奶和袋裝豆腐干的生產(chǎn)過程中使用，且其成品中不得殘留。因此，對食品中痕量H2O2的檢測十分必要。

目前，檢測H2O2主要基于酶（模擬酶）催化，檢測的方法有電化學(xué)法［1］、流動注射分析法、色譜法、分光光度法、熒光法［2］和化學(xué)發(fā)光法［3］等。 天然酶試劑昂貴、不易儲存、實(shí)驗操作繁瑣且受溫度等多種因素影響，難以普及應(yīng)用。近幾年，納米粒子催化性能的研究及分析應(yīng)用十分廣泛，研究證明小粒徑的納米金具有很好的催化性能［4］，以納米金為催化劑建立起來的催化增強(qiáng)技術(shù)，大大提高了檢測方法的靈敏度［5］。 2007 年，閻錫蘊(yùn)研究小組［6］發(fā)現(xiàn)磁性納米Fe3O4顆粒具有類過氧化物酶的催化功能，這一發(fā)現(xiàn)拓展了磁性納米Fe3O4顆粒的應(yīng)用范疇，使得納米Fe3O4在過氧化物催化領(lǐng)域的應(yīng)用成為一個熱點(diǎn)［7-9］，但有關(guān)納米Fe3O4催化氧化甲基橙分光光度法檢測H2O2尚未見報道。筆者以甲基橙（MO）為底物，納米Fe3O4模擬酶對過氧化氫氧化甲基橙褪色反應(yīng)具有催化作用，據(jù)此建立了納米Fe3O4催化氧化甲基橙測定痕量H2O2的新方法，該法兼有光度法的簡便性、催化法靈敏度高和成本低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：UV 2700型雙光束紫外-可見分光光度計、Quanta 200 FEG場發(fā)射掃描電子顯微鏡、SYZ-550型石英亞沸蒸餾水器、DK-8B型電熱恒溫水槽。

試劑：H2O2儲備液8.8 mol/L（用高錳酸鉀法標(biāo)定），使用時用水稀釋至所需濃度；FeCl3·6H2O；FeSO4·7H2O；1.00 mg/mL 甲基橙水溶液；pH 為 1.42的0.2 mol/L（以NaAc計）HCl-NaAc緩沖溶液。試劑均為分析純，實(shí)驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米Fe3O4的制備

采用超聲輔助反向共沉淀法制備Fe3O4：準(zhǔn)確量取15 mL二次水于錐形瓶內(nèi)，水浴加熱至80℃，在強(qiáng)磁力攪拌下加入用5 mL二次水溶解過的2.025 g FeCl3·6H2O 和 1.475 g FeSO4·7H2O 混合溶液， 逐滴加入5 mL濃氨水，繼續(xù)恒溫攪拌1.5 h；冷卻后強(qiáng)磁鐵吸附分離，用二次水多次洗滌至中性，加水定容到100 mL，避光密封保存，F(xiàn)e3O4的質(zhì)量濃度為8.68 g/L。圖1為納米Fe3O4掃描電鏡照片。結(jié)果表明，該納米微粒平均粒徑為20 nm。主要化學(xué)反應(yīng)式：

圖1 納米Fe3O4掃描電鏡照片

1.3 實(shí)驗方法

在5 mL具塞比色管中，依次加入0.2 mL經(jīng)超聲波處理的0.868 g/L納米Fe3O4溶膠、0.2 mL且pH為1.42的HCl-NaAc緩沖溶液和0.2 mL質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL甲基橙水溶液，加入一定量H2O2，用二次蒸餾水定容至1.5 mL，搖勻后放到60℃水浴鍋中。15 min后取出，冰水冷卻2 min后，強(qiáng)磁鐵吸附分離，靜置2 min，取上清液以水為參比，在506 nm處測定吸光強(qiáng)度（A），同時測定不加H2O2的空白溶液吸光度（A0），計算吸光度的差：ΔA=A0-A。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法原理

納米Fe3O4具有過氧化物酶性質(zhì)，在pH=1.42的HCl-NaAc緩沖溶液、60℃條件下催化分解H2O2產(chǎn)生羥基自由基，羥基自由基氧化底物MO得到無色混合產(chǎn)物（圖 2）［10］，體系顏色由紅色逐漸變淺，最終顏色完全褪去，導(dǎo)致體系在506 nm處吸光度減小，隨著H2O2濃度的增加，生成的產(chǎn)物增多，吸光度差ΔA線性降低。據(jù)此可以建立一種簡便靈敏檢測H2O2的新方法。

圖2 納米Fe3O4催化氧化甲基橙褪色

2.2 紫外-可見吸收光譜

圖3為納米Fe3O4催化體系紫外吸收光譜圖。在pH=1.42的介質(zhì)中，MO水溶液在506 nm處有強(qiáng)吸收，加入納米Fe3O4催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基后，底物MO逐漸被羥基自由基氧化生成無色的產(chǎn)物，從而使體系在506 nm處的吸收信號不斷降低。由圖3可見，隨著H2O2濃度的增大，各體系在506nm處的吸光度逐漸降低，說明MO被納米Fe3O4模擬酶催化過氧化氫氧化褪色。綜合考慮，實(shí)驗選擇506 nm處為測定波長。

圖3 納米Fe3O4催化體系紫外吸收光譜圖

2.3 測定條件優(yōu)化

2.3.1 HCl-NaAc緩沖溶液的影響

實(shí)驗首先考察了緩沖溶液pH及用量對體系ΔA的影響。結(jié)果如圖4、圖5所示。由圖4、5可以看出，當(dāng)pH和HCl-NaAc用量分別為1.42和0.2 mL時，ΔA可達(dá)到最大值。因此，實(shí)驗選用pH=1.42的HCl-NaAc緩沖溶液0.2 mL。

圖4 pH對吸光度差的影響

圖5 HCl-NaAc緩沖溶液用量對吸光度差的影響

2.3.2 納米Fe3O4催化劑用量的影響

按照1.3節(jié)的實(shí)驗方法，考察了納米Fe3O4催化劑用量對體系ΔA的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可見，最初隨著催化劑用量增大，體系ΔA也增大，當(dāng)催化劑用量達(dá)到0.2 mL時，ΔA達(dá)到最大；當(dāng)用量超過0.2 mL時，體系ΔA反而下降，這可能是由于納米Fe3O4的吸附作用致使體系A(chǔ)0減小，從而造成ΔA減小。因此，實(shí)驗選擇適宜的納米Fe3O4用量為0.2 mL。

圖6 納米Fe3O4催化劑用量對吸光度差的影響

2.3.3 反應(yīng)溫度的影響

按照1.3節(jié)的實(shí)驗方法，考察了不同反應(yīng)溫度對體系ΔA的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，在30～60℃時，ΔA隨著溫度的升高而增大，說明溫度升高，催化體系的反應(yīng)程度加劇；當(dāng)溫度為60℃時，ΔA達(dá)到最大；溫度大于60℃時，由于溫度過高，H2O2自行分解加劇，從而造成體系ΔA降低。因此，實(shí)驗選擇最佳反應(yīng)溫度為60℃。

圖7 催化反應(yīng)溫度對吸光度差的影響

2.3.4 反應(yīng)時間的影響

按照1.3節(jié)的實(shí)驗方法，考察了不同反應(yīng)時間對體系ΔA的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當(dāng)反應(yīng)時間為15 min時，ΔA即達(dá)到最大值，繼續(xù)增加反應(yīng)時間，ΔA呈下降趨勢。因此，實(shí)驗選擇最佳反應(yīng)時間為15 min。

圖8 催化反應(yīng)時間對吸光度差的影響

2.4 共存物質(zhì)的影響

按照1.3節(jié)的實(shí)驗方法，在H2O2濃度為1.76 μmol/L的條件下，考察了共存物質(zhì)對體系的影響。結(jié)果表明，相對誤差不超過5%時，各干擾物質(zhì)的共存量（倍）：F-、CO32-、K+、Cl-、Na+、NO32-、Al3+、Fe2+（1000），PO43-、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+（50）， 檸檬酸（500），抗壞血酸、乳酸（200）， EDTA、甲醛（25）。

2.5 線性關(guān)系

在最佳實(shí)驗條件下，測定不同濃度的H2O2對應(yīng)的ΔA，以濃度c對ΔA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗結(jié)果表明，雙氧水濃度在1.17～35.2 μmol/L范圍內(nèi)與ΔA存在良好的線性關(guān)系。回歸方程為ΔA=0.0149c+0.0917，相關(guān)系數(shù)為r=0.9955，檢出限為0.6μmol/L。

2.6 樣品的分析

稱取牛百葉50 g，浸于50 mL二次水中24 h，過濾取清液，于冰箱中冷藏保存，腐竹預(yù)處理方法與處理牛百葉方法相同，按實(shí)驗方法測定樣品中的H2O2，并對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗，同時做空白加標(biāo)實(shí)驗（見表1）。由表1結(jié)果可知，在5次平行樣品測定中，樣品加標(biāo)回收率為95.5%～98.3%，空白加標(biāo)回收率為102.8%，結(jié)果令人滿意。

表1 樣品測定結(jié)果及回收率實(shí)驗（n=5）

［1］Wang Gang，Xu Jingjuan，Chen Hongyuan，et al.Amperometric hydrogen peroxide biosensor with sol-gel/chitosan network-like film as immobilization matrix ［J］.Biosensors and Bioelectronics，2003，18（4）：335-343.

［2］ChenHongqi，YuHupeng，ZhouYunyou，etal.Fluorescentquenching methodfordeterminationoftracehydrogenperoxideinrainwater［J］.Spectrochin mica Acta PartA：Molecularand Biomolecular Spectroscopy，2007，67（3/4）：683-686.

［3］Marle L，Greenway G M.Determination of hydrogen peroxide in rainwater in a miniaturised analytical system ［J］.Anal.Chim.Acta，2005，548（1/2）：20-25.

［4］溫桂清，梁愛惠，廖獻(xiàn)就.檢測痕量納米金的納米催化光度法［J］.分析測試技術(shù)與儀器，2008，14 （4）：195-198.

［5］Jiang Zhiliang，Liao Xianjiu，Deng Anping，et al.Catalytic effect of nanogold on Cu（Ⅱ）-N2H4reaction and its application to resonance scattering immunoassay［J］.Anal.Chem.，2008，80（22）：8681-8687.

［6］Gao Lizeng，Zhuang Jie，Nie Leng，et al.Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles and application in an immunoassay［J］.Nature Nanotechnology，2007，2（9）：577-583.

［7］Ouyang Huixiang，Wang Lisheng，Tian Jianniao，et al.A simple and sensitive nanocatalytic fluorescence method for the determination of folic acid in foods using Fe3O4nanoparticle-K2S2O8system ［J］.Food Analytical Methods，2013，6（1）：76-81.

［8］Ouyang Huixiang，Liang Aihui，Tian Jianniao，et al.Catalytic spectrophotometric determination of trace H2O2using Fe3O4nanoparticlesasperoxidasemimetics ［J］.AppliedMechanicsandMaterials，2013，319：39-42.

［9］Zhang Zhanxia，Wang Zhongjun，Wang Xiaolei，et al.Magnetic nanoparticle-linked colorimetric aptasensor for the detection of thrombin ［J］.Sensors and Actuators B：Chemical，2010，147 （2）：428-433.

［10］朱燕，郁志勇，孫震，等.過氧化氫存在下甲基橙光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定［J］.甘肅科學(xué)學(xué)報， 2004，16（2）：44-46.