梅毒螺旋體基因重組抗原及其血清學(xué)診斷研究進(jìn)展

莫顯文

導(dǎo)致人體感染梅毒的致病菌為蒼白螺旋體的亞種-密螺旋體（TP），感染人體的主要致病菌株為Nichols株。梅毒螺旋體的細(xì)胞質(zhì)被3層細(xì)胞質(zhì)外膜包裹著，而暴露于外膜的跨膜蛋白數(shù)量較少，但跨膜蛋白在臨床中對于梅毒的診斷確診有著極大的實(shí)際價值[1]。在實(shí)際的臨床操作中，很難對梅毒螺旋體進(jìn)行體外培養(yǎng)，確診梅毒的方式由培養(yǎng)梅毒螺旋體替代為利用梅毒螺旋體的重組抗原進(jìn)行對應(yīng)的檢測。

1 梅毒螺旋體基因重組抗原的研究進(jìn)展

1.1 Tpr基因家族 Tpr基因家族涵蓋了12個蛋白，這12個蛋白按照同源性氨基酸的分類應(yīng)該屬于3個不同的亞型，其中Ⅰ亞型為Tpr C、D、F、I，Ⅱ亞型為Tpr E、G、J，Ⅲ亞型為 A、B、H、L、K[2]。在這 3 個亞型中，在梅毒感染兔的模型中，誘導(dǎo)T細(xì)胞以及強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)的為Tpr K，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示著使用Tpr免疫能夠有效地減弱梅毒患者損傷后病情的進(jìn)一步發(fā)展。在分子結(jié)構(gòu)學(xué)上，對于Tpr家族的Ⅰ亞型而言，其中它們的C端和N端高度相似于F端和N端，特別是在Tpr的C、D兩個亞型之間，它們C端結(jié)構(gòu)的相似度高達(dá)94%[3]。在對Tpr家族的抗原氨基末端的重組性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這些抗原對于感染梅毒患者的損傷的進(jìn)展有著一定程度的減弱作用，這些重組抗原很可能起著關(guān)鍵作用的階段為梅毒患者的不完全免疫階段。

1.2 TpN15、TpN47、TpN17、TmpA 1989 年 有 學(xué)者利用兔子的抗體血清成功的篩查出了Tp基因組中的6個重組克隆，且利用Western法以及電泳法成功的篩選出了TpN15、TmpA、TpN17等3個蛋白[4]。在1996年，相應(yīng)的學(xué)者在通過對梅毒螺旋體的結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，他們利用PCR法對梅毒螺旋體內(nèi)的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的基因插入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果獲得了TpN47、TpN35、TpN44.5、TpN29-35、TpN39等抗原，接下來的ELISA法實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)上述抗原中引起抗體滴度最高的為TpN47、TpN17、TpN44.5[5]。在后續(xù)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，學(xué)者重組并成功表達(dá)了TpN47的載體pGEX-2T，并成功證實(shí)了其具有免疫原性，同時有學(xué)者的相關(guān)實(shí)驗(yàn)還成功的證實(shí)了TpN47是一種能夠與青霉素進(jìn)行結(jié)合的蛋白，并且發(fā)現(xiàn)TpN47與青霉素結(jié)合的位點(diǎn)有3個，同時還證實(shí)TpN47本身是一種具有鋅依賴性的羧肽。有學(xué)者通過重疊多肽的方法成功的找出了位于TpN47上的抗原表位[6]。

1.3 TROMP TROMP對于梅毒具有免疫原性，而在TROMPs的表面可能存在著免疫宿主的介導(dǎo)區(qū)和致病力決定區(qū)，在TROMP的表面上存在著17-kDa、28-kDa、31-kDa、45-kDa、65-kDa。其中存在于TP內(nèi)膜原生質(zhì)體復(fù)合物中的主要為17-kDa和45-kDa，而存在于外膜的主要為28-kDa、31-KDa以及65-kDa[7]。在天然重組蛋白質(zhì)中，28-kDa、31-kDa、65-kDa就天然的具有抗原性質(zhì)，28-kDa主要在外膜中進(jìn)行表達(dá)，并且與跨膜蛋白存在著高度相似的序列，65-kDa其整體數(shù)量雖然較少，但是仍然被認(rèn)定為具有抗原免疫性，而31-kDa被證明具有能夠形成微管的能力，從而被間接的證實(shí)為跨膜蛋白。目前國外的相應(yīng)研究已經(jīng)明確，TP分子本身的免疫反應(yīng)能夠產(chǎn)生高滴度的TP抗體，在上述反應(yīng)過程中，TROMPs能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生對應(yīng)的抗體。在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有自然的TP感染才能夠產(chǎn)生真正的血清吞噬作用，而使用滅活的Tp重組抗原并不能夠產(chǎn)生真正意義上的血清吞噬作用[8]。在對TROMP1的各項(xiàng)重組實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，在電子顯微鏡下可以明顯發(fā)現(xiàn)在Tp感染的血清中，TROMP1的表達(dá)主要是在重組菌的表面表達(dá)，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)還證實(shí)對于rTROMP1而言，其定位于E.coil的外膜，并且同時兼有表面抗原性以及微孔體系。

1.4 Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453、Tp92 在1998年的實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)對于Tp92而言，其極有可能是Tp的抗原之一，并通過PET-3a T7載體重組表達(dá)了Tp92，通過對表達(dá)后的Tp92進(jìn)行相應(yīng)的檢測發(fā)現(xiàn)，Tp92確實(shí)具有抗原免疫性[9]。Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453都是通過PCR擴(kuò)增法進(jìn)行了去除N端信號肽的全長表達(dá)，且表達(dá)后的這6個蛋白均進(jìn)行了臨床血清學(xué)的檢測，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對于Tp0155、Tp0751、Tp0483而言，實(shí)驗(yàn)的靈敏度為28%~42%之間，而對于Tp0453而言，其中檢測的靈敏度和特異度均為100%，Tp92的特異度為97%、靈敏度為98%。其中學(xué)者描述了Tp0453的除去兩段端肽的結(jié)構(gòu)，但近些年來的實(shí)驗(yàn)研究則顯示，Tp0453的結(jié)構(gòu)目前與所有已知的外膜蛋白都不相同，Tp0453缺少一種β桶結(jié)構(gòu)，正是因?yàn)槿鄙龠@種結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Tp0453無法橫跨外膜，從而避免暴露于Tp的菌體外膜表面[10]。正是因?yàn)門p0453的這種結(jié)構(gòu)特殊性，有學(xué)者認(rèn)為對于Tp0453極有可能代表一大類的新的細(xì)菌外膜蛋白。國內(nèi)有學(xué)者新組了Tp0453并對其進(jìn)行了臨床評價，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tp0453應(yīng)該可以被用于ELISA反應(yīng)[11]。

1.5 Tp4D以及TpN37 在1986年的國外學(xué)者的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中就已經(jīng)證實(shí)，對于Tp4D而言，其確實(shí)具有抗原免疫性，同時相應(yīng)的ELISA法也證實(shí)，4D的ELISA能夠檢測到的抗4D特異性抗體為25 ng，且在檢測的靈敏度上可以與免疫熒光法相媲美，但是Tp4D的一個重大缺陷就是存在著與地方性梅毒菌種的一個交叉反應(yīng)[12]。同樣在1986年，國外學(xué)者使用5.6 kb的TpDNA的重組基因的質(zhì)粒做出內(nèi)切酶圖譜后，再成功地轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)。利用免疫雜交點(diǎn)的方法對TpN37進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，對于梅毒二期的血清檢測有效，如果改變檢測的方法，利用放免和酶免的方法進(jìn)行相應(yīng)的檢驗(yàn)，TpN37與所有血清中的抗體都能夠發(fā)生反應(yīng)，但唯一的不足是對于陰性對照則沒有反應(yīng)表現(xiàn)出。在兔梅毒模型中，利用兔子血清制作的特異性兔單克隆抗體能夠有效地被TpN37抗原，并且TpN37抗原不會與其他的非致病性的螺旋體發(fā)生反應(yīng)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示對于TpN37而言，其能夠有效的作為血清診斷梅毒的有效抗原[13]。

2 梅毒螺旋體基因重組抗原血清學(xué)診斷的研究進(jìn)展

有相應(yīng)的臨床大樣本量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，Tp凝血實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果與利用Tp基因重組抗原的臨床快速檢測在檢測的靈敏度上無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但Tp單一基因重組抗原對于合并了HIV感染，或者是已經(jīng)接受了一段時間的抗梅毒治療的患者，或者是處于潛伏期的梅毒患者而言，其檢測的靈敏度會大大下降，而如果使用多基因重組的Tp重組基因抗原，則其檢測的整體靈敏度將會大大提高，出現(xiàn)的假陰性的比例會大大減小[14]。

2.1 免疫層析實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展 利用Tp基因重組的抗原包被膜條測試區(qū)時，當(dāng)抗原中的IgG/IgM與膜條測試區(qū)域中的標(biāo)記的抗人IgG/IgM結(jié)合后，結(jié)合后的復(fù)合物最終層析到膜條測試區(qū)與特異抗原結(jié)合后所呈現(xiàn)出來的顯色標(biāo)記就為陽性反應(yīng)標(biāo)記[15]。在TPHA的評價標(biāo)準(zhǔn)下，有學(xué)者將4種不同國家生產(chǎn)的免疫層析試劑盒用來進(jìn)行評價，結(jié)果這4個國家的免疫層析試劑盒的最終檢測結(jié)果顯示，不論是在全血還是在血清檢測的敏感性上，都取得了良好的結(jié)果，上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓人相信在不遠(yuǎn)的將來，免疫層析實(shí)驗(yàn)將有可能取代傳統(tǒng)的篩查實(shí)驗(yàn)。

2.2 Tp-ELISA的研究進(jìn)展 在目前的Tp-ELISA研究中，聚苯乙烯反應(yīng)板微孔在被Tp重組基因抗原包被，且抗人IgG/IgM在被酶標(biāo)記的情況下，可以有效的對Tp的IgG/IgM進(jìn)行檢測。在雙抗原夾心的ELISA法中，酶和反應(yīng)板均對Tp重組的酶抗原進(jìn)行了標(biāo)記。在利用Tp的3種組合表達(dá)蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA檢測實(shí)驗(yàn)與性病研究實(shí)驗(yàn)、熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)以及TPHA實(shí)驗(yàn)的檢測靈敏度、特異度相比，利用Tp的3種組合表達(dá)蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的 ELISA檢 測 實(shí) 驗(yàn) 的對處于不同分期的梅毒患者的檢測的靈敏度、特異度均要顯著高于其他3種方法。而國外學(xué)者在利用重組的TpN17-15-ELSIA法與WB、以及THBA法相比，在對正常人和含有疾病的2950份血清的檢測中，TpN17-15-ELSIA法與WB法均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，而THBA法則出現(xiàn)了交叉反應(yīng)[16]。而在對Tp多基因嵌合重組抗原與Tp單基因重組抗原的平行檢測中發(fā)現(xiàn)，Tp多基因嵌合重組抗原檢測的靈敏性要顯著高于Tp單基因重組抗原，在對雙抗原夾心ELISA法與間接ELISA法的比較中，雙抗原夾心ELISA法的檢測準(zhǔn)確性要顯著優(yōu)于間接ELISA法。而目前在投入商業(yè)化使用的Tp重組基因的ELSIA法檢測試劑盒中，其檢測的靈敏度和特異度均為100%。

2.3 快速乳膠凝集試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)的原理上，快速乳膠凝集試驗(yàn)的基本原理與Tp的顆粒凝集試驗(yàn)相似。在臨床實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者利用TpN15、TpN17、TpN47作做為抗原，利用快速乳膠凝集試驗(yàn)法快速檢測了1518份隨機(jī)得來的血清樣本，將檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同VDRL法的特異度進(jìn)行檢測，并同時期檢測99分梅毒血清樣本，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，快速乳膠凝集試驗(yàn)與VDRL法檢測的特異度并無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[17]。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在梅毒的篩查中可以考慮使用快速乳膠凝集試驗(yàn)。

2.4 CLIA法 CLIA法的中文名稱為化學(xué)發(fā)光免疫分析，其基本原理為將固相抗原設(shè)定為Tp基因重組抗原，利用HRP對第二抗原進(jìn)行標(biāo)記，同時使用含魯米諾或者是其對應(yīng)的增強(qiáng)劑作為示蹤劑，通過最后測量其發(fā)光數(shù)值的方法來進(jìn)行檢測。我國學(xué)者通過使用TpN15、TpN17、TpN47作為對應(yīng)的酶標(biāo)抗原和固相抗原，成功的建立了基于Tp為雙抗原夾心的CLIA法，通過與TRUST、TPPA、TPHA、Tp-ELISA法 平 行 的 檢 測 Tp抗體檢測分別呈陽性和陰性的血清，結(jié)果最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這4種方法的陽性檢測率和陰性檢測率均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[18]。

2.5 WB法 將Tp的重組基因抗原通過SDS-PAGE通過電印轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，再與待檢測的血清進(jìn)行檢測后通過酶標(biāo)記抗人的IgG/IgM。其實(shí)驗(yàn)的基本原理為，如果待檢測的血清中存在TpN15、TpN17、TpN42、 TpN47、TpN37等抗體，則加酶的底物可以出現(xiàn)反應(yīng)，并且能夠顯色。有國外學(xué)者將rpN47、rTpNl7、rTpNl5、rTpN42、rTpN37這5種多肽進(jìn)行重組建立recWB法，并與MHA-Tp以及wclWB對比進(jìn)行梅毒血清的檢測，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在各項(xiàng)綜合指標(biāo)的評價中，recWB法要顯著優(yōu)于wclWB法[19]。

目前部分Tp重組基因的抗原已經(jīng)應(yīng)用于臨床梅毒的檢測中，其中涉及的Tp基因重組的抗原主要為TpN15、TpN17、TpN47，在初期使用的Tp基因重組抗原多為單一基因的抗原，現(xiàn)在則多為多基因嵌合的抗原，雖然對于各期梅毒的檢查靈敏度和特異度得到了極大的提高，但是仍然存在著較大的不足，且在實(shí)際中對于何種Tp抗原的檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，仍然存在著較大的爭議[20]。目前隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，已經(jīng)逐步能夠解決難以從Tp中純化的微量蛋白數(shù)量問題，并已經(jīng)能夠?qū)ζ渚唧w的作用機(jī)制展開相應(yīng)的研究。這也意味著，Tp基因重組抗原應(yīng)用于梅毒的檢測中的前景更為廣闊。

[1]暴銀鳳，吳瓊杉，余銘恩.梅毒螺旋體多表位重組抗原的研制及其應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（3）：210-212.

[2]許美蓉，韋善求.梅毒螺旋體基因重組抗原研究及其臨床應(yīng)用[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，35（1）：90-92.

[3]章剛，黃德新，駱曉棟.梅毒螺旋體重組抗原TpN47的純化工藝研究[J].中國藥業(yè)，2013，22（21）：4-5.

[4]劉小軍，牛淑會，蔡嘉怡，等.梅毒螺旋體重組蛋白Tp0608的表達(dá)與鑒定[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41（4）：341-343，360.

[5] Sato N S， Suzuki T， Ueda T， et al. Gene cloning and expression of the Tp0453 antigen immuno-dominant epitope fragment of Treponema pallidum and its potential use in serodiagnosis of syphilis[J]. Chinese Journal of Infectious Diseases，2013，31（9）：524-528.

[6]王磊陽，陳政卓，富夢楚，等.梅毒螺旋體外膜蛋白Tp0136的制備及在血清學(xué)診斷中的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（5）：1045-1047，1053.

[7] Li J， Zheng H Y， Wang L N， et al. Expression， purification and immunocompetence analysis of a Treponema pallidum recombinant protein TP0993[J]. Chinese Journal of Dermatology，2013，46（5）：305-308.

[8]龍福泉，王千秋，張津萍，等.梅毒螺旋體重組蛋白Tp0136的表達(dá)、純化及免疫活性分析[J].中華皮膚科雜志，2012，45（6）：396-399.

[9]曾鐵兵，裴瑞青，張躍軍，等.梅毒螺旋體Tp 0993重組蛋白的表達(dá)及鑒定[J].南華大學(xué)學(xué)報·醫(yī)學(xué)版，2010，38（5）：598-600.

[10]吳穎，曹景宏，唐玉霞，等.梅毒螺旋體重組蛋白rTpN37為抗原的ELISA的建立與RPR和TPPA血清學(xué)檢測效果的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（10）：2491-2493.

[11]朱中元，張丹，王海波，等.結(jié)核分枝桿菌CFP-10與Rv2626c蛋白的表達(dá)及血清學(xué)診斷研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2012，28（12）：1212-1215.

[12]馬開富，劉勝武.梅毒血清學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（1）：63-66.

[13]曹文芩，宋文忠，畢超.六種梅毒初篩試驗(yàn)試劑的評價[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（2）：129-130.

[14]徐慧杰，徐杰前，候玨.梅毒抗體篩查可疑感染獻(xiàn)血員回訪結(jié)果分析[J].中國輸血雜志，2010，23（9）：724-725.

[15]李鄭紅，陸倫根.肝纖維化血清學(xué)診斷研究進(jìn)展[J].國際消化雜志，2013，33（5）：295-297.

[16]席艷華，劉金濤.梅毒螺旋體的檢測方法和臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（20）：2375-2376.

[17]姜烜星，王濤，陳曉琴.1910例住院患者梅毒血清學(xué)檢測結(jié)果分析[J].中國臨床研究，2010，23（5）：40.

[18]方偉禎，謝文鋒，丁睿，等.300例住院患者梅毒血清學(xué)試驗(yàn)陽性結(jié)果分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2011，6（3）：9-11.

[19]郭琦，陳秀芹，孫海斌，等.抗sTn抗體3P9和B72.3在子宮內(nèi)膜癌血清學(xué)診斷中的對比研究[J].中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，38（11）：1117-1121.

[20] An Y， Han W， Chen X， et al. A novel anti-sTn monoclonal antibody 3P9 inhibits human xenografted colorectal carcinomas[J]. J Immunother，2013，36（1）：20-28.