杜仲育種研究進展

王大瑋+汪元超+李根前+李周岐

摘要：從杜仲常規育種、生物技術育種方面對杜仲遺傳育種研究現狀進行總結，提出了今后杜仲育種的研究方向和發展趨勢，為我國杜仲生產和開發利用提供參考。

關鍵詞：杜仲；遺傳育種；研究進展

中圖分類號：S567.1+90.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0007-04

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）屬杜仲科植物，該科僅1屬、1種，為地質史上第三紀冰川運動殘留下來的古生樹種^[1]，還是我國特有的名貴經濟樹種^[2]。鑒于其起源古老，具有重要的研究價值及重要的藥用價值，已被列為國家二級保護植物^[3]。杜仲自古以皮入藥而著稱，具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、增強免疫力等藥效，特別是對血壓獨有的雙向調節作用對維持人體健康具有至關重要的作用^[4-5]。杜仲既是貴重藥材，又是提取天然橡膠的工業原料^[6]，此外還是很好的用材樹種、園林綠化及水土保持樹種。因此，杜仲是一種集經濟效益、生態效益、社會效益于一身的植物，具有極高的開發利用價值^[7]。目前國內外對杜仲的綜合開發利用涉及醫藥衛生、能源化工以及園林綠化等多個領域，已形成一個利用多學科綜合研究開發的全新格局。為了更進一步開發利用杜仲資源，本文綜述了杜仲的遺傳育種研究成果，以期為杜仲的大規模開發利用及生產提供參考。

1 國內外杜仲研究概況

1.1 國外杜仲研究概況

由于杜仲具有較高經濟價值，自1940年起前蘇聯、美國、日本、韓國、瑞典、西班牙、墨西哥、英國等國先后對杜仲進行研究，相關研究主要集中在杜仲有效成分的提取及利用等方面。目前對杜仲的研究以日本最為領先，其次為中國^[8]。日本對杜仲的研究涉及種質資源培植、成分分析、藥理試驗、產品研制、市場開發等方面^[9]。近年來，英國、韓國也在杜仲愈傷組織誘導、血管緊張素化酶抑制劑等化學成分的提取和分析、藥理及保健功能的研究方面取得了一定成果^[10]。

1.2 我國杜仲研究概況

我國早在2 000多年前就開始對杜仲進行栽培和藥理方面的研究，《草本神農經》《本草綱目》《本草備要》等古代著名藥書都有詳細記載。目前我國對杜仲的研究主要集中在遺傳育種^[11]、藥材用林營造與栽培^[12-13]、組培快繁^[14-15]、活性成分提取及分析^[16-17]、藥理及保健功能研究等方面^[18-19]。近年來隨著杜仲橡膠產業的蓬勃發展，杜仲橡膠提取工藝及膠用新品種選育方面的研究^[20-21]也獲得了成功。

2 杜仲育種

我國系統開展杜仲遺傳育種工作始于20世紀80年代，以西北農林科技大學和河南省洛陽市林業科學研究所為主的一些單位在杜仲常規育種、生物技術育種方面作了大量研究，并取得了一定成果。

2.1 常規育種

2.1.1 種質資源區劃和保存

由于杜仲皮藥用價值較高，20世紀80年代初非法商販在川陜等地大量收購杜仲皮，導致野生杜仲資源遭到嚴重破壞，直至杜仲被列為國家二級保護植物后育種工作者才開始開展杜仲資源的收集保護工作^[22]。張維濤等根據杜仲生物學特性和栽培現狀，對全國杜仲栽培資源進行區劃，劃分出中心栽培區、主要栽培區、邊緣區、引種區^[23]。20世紀90年代末陳品良等根據自然地理特點、經濟性狀、形態特點上的差異，劃分出杜仲的7個主要分布區：秦巴山區、大婁山區、鄂西山區、武陵山區、伏牛山-桐柏山-大別山區以及浙、贛、皖交界山區和南嶺山區^[24]。此后四川、貴州、河南、湖南、河北等省對當地杜仲種質資源分別進行了調查和收集[22，25-28]。21世紀初中國林業科學研究院經濟林研究開發中心建立了世界上最大的杜仲種質資源庫，共收集保存了600余份杜仲優良基因資源^[29]。武漢植物園發現了1株指紋圖譜與栽培杜仲差異很大的200多年樹齡雄性古樹，被認為是野生杜仲滅絕后發現的重要野生種質資源^[30]。這些都為我國杜仲育種工作提供了寶貴的基因資源。

2.1.2 引種

杜仲為我國特有樹種，僅在我國部分地區有野生資源，其他國家的杜仲資源均引種自我國^[31]。1890年杜仲首次被引入歐洲，先被引入法國，幾年后被引入英國，1899年被引入日本，1906年被傳入俄國，1907年被引入美國。除上述國家外，先后從我國引種杜仲的國家還有韓國、德國、匈牙利、印度、朝鮮、加拿大等。目前杜仲已在歐洲、美洲、亞洲的十多個國家和地區安家落戶^[32]。

由于杜仲適應性強，在我國亞熱帶、暖溫帶的大部分地方均能正常生長發育。杜仲除在與其主要栽培區鄰近、氣候土壤條件相似的江西、廣西、福建、廣東等地得到較大發展外，距主要栽培區較遠的甘肅、寧夏、北京、河北、天津、山東、遼寧、陜北、吉林、新疆、云南、上海等省（市、區）的部分地區，也先后引種獲得成功。目前除海南、臺灣、黑龍江、西藏等地外的27個省（區、市）均有杜仲種植[29，31]。

2.1.3 良種選育

河南省洛陽市林業科學研究所等單位根據多年系統研究，通過培育同齡苗、無性系苗期測定、多點造林測定、區域試驗，選育出我國首批杜仲優良品種華仲1號至華仲5號，填補了我國杜仲良種的空白，對杜仲生產逐步實現良種化具有積極引導和推動作用^[33]。此后，研究者從樹皮特征、枝條變異特點、葉片、果實特征等方面將杜仲劃分為不同類型，并總結其形態特征和經濟價值等，為挖掘優良杜仲基因資源和杜仲遺傳改良研究提供材料^[34]。在此基礎上，針對不同育種目標分別選育出適于營建杜仲良種果園、生產杜仲膠和杜仲亞麻酸油的華仲6～9號^[35-38]。同時還選育出具有特異性狀的杜仲良種紅葉杜仲和密葉杜仲，目前已審定杜仲良種5個，認定杜仲良種1個^[29]。西北農林科技大學通過有效成分分析，選出杜仲優良種源區和優良類型^[39]；在此基礎上選擇優樹，建立了無性系測定林^[40]；然后以有效成分為首選指標，結合生長量、抗性等指標，選出14個優良無性系；最后通過優良無性系區域栽培試驗，選育出有效成分含量高且性狀穩定的優良品種秦仲1號至秦仲4號，其產量和品質較野生杜仲均有一定程度提高^[11]。

2.1.4 雜交育種

雜交育種是培育新品種的傳統方法之一，近年來關于杜仲雜交育種的研究也在進行中。西北農林科技大學選擇性狀差異較大的12個杜仲優良品種（無性系）各1株作為雜交親本，按析因交配設計組成35個雜交組合進行人工雜交，得到7個較大的F1全同胞家系^[41]；測定了這些2年生杜仲雜種苗苗期表型性狀，并對苗高、地徑、葉面積等性狀的遺傳參數進行了分析；結果表明杜仲雜交子代的苗期表型性狀差異顯著，可以進行家系間和家系內的初步選擇，其中5個家系各性狀的特殊配合力相對較高，可用于進一步雜交選育杜仲良種^[42]。

2.1.5 多倍體育種

人工誘導多倍體是獲得植物新類型或新種質的重要途徑之一。20世紀90年代初就有了杜仲三倍體誘導成功的報道^[43]，此后我國對杜仲多倍體誘導進行了大量研究。西北農林科技大學先后利用60Co輻射處理萌動種子和秋水仙素處理杜仲幼苗頂端生長點，成功誘導出形態變異的單株，但誘導后染色體數目是否發生變化尚不明確^[44-45]。成都大學、北京林業大學分別使用秋水仙素對杜仲種子和花粉染色體進行人工誘導加倍，經植物形態學和染色體數檢測，誘導后的材料具有明顯的多倍體特征^[46-47]。河北農業大學的郭海鳳等采用秋水仙素溶液處理生長點的誘變方法對杜仲籽苗進行誘導，對獲得的 148個變異株進行染色體數檢測及DNA 相對含量測定后，鑒定出47株為四倍體，而且這些四倍體植株明顯表現出多倍體的特征^[48]。然后對其主要藥用成分、杜仲膠等進行了測定，從中篩選出生長快、抗性強、有效成分含量高的優良四倍體植株^[49]。

2.2 生物技術育種

2.2.1 組織培養

杜仲造林以種子繁殖為主，但其發芽率較低，而且實生個體之間的有效成分含量差異較大，不利于新品種選育。組織培養技術可以大大縮短育種周期，而且可以提高品質^[50]。杜仲組織培養從20世紀80年代就已經開始，經過30年研究，技術已經逐漸趨于成熟。目前除子葉外，葉片、葉柄、腋芽、胚軸、帶芽莖段、莖尖、子葉等外植體在不同再生體系中均獲得了再生植株。由于杜仲的體細胞胚發生還未能突破，所以杜仲苗的工廠化生產在一定程度上受到限制^[51]。

2.2.2 遺傳多樣性研究

近年來隨著分子生物學的高速發展，有關先進技術在杜仲育種研究中也得以應用。杜仲RAPD、AFLP、ISSR、SSR等分子標記反應體系相繼被建立[7，52-54]，為分子水平上的杜仲育種研究提供了技術支持。王媛琦等以20年樹齡栽培杜仲的16個群體共260個個體為研究對象，利用RAPD分子標記技術對其遺傳多樣性和居群遺傳結構進行了研究。結果表明，杜仲種內具有豐富的遺傳多樣性，各群體內部的遺傳多樣性較低。認為杜仲群體間已發生了高度的遺傳分化，在此基礎上提出了“盡可能保護更多的種群”的保護策略^[55]。武漢植物園在上述研究基礎上擴大了研究樣本量，以15～30年生的9個栽培群體和1個半野生群體共582個個體為材料，利用穩定性高于RAPD的SSR、AFLP 2種標記分別從葉綠體DNA及核基因DNA角度再次對杜仲遺傳多樣性進行分析。結果表明栽培群體間的遺傳多樣性較低，神農架半野生群體與其他栽培群體相比，表現出很高水平的遺傳多樣性。說明人工選擇是導致栽培品種遺傳多樣性降低的主要原因。而各群體內的遺傳多樣性表現為中等水平。這與RAPD標記分析結果有一定差異，認為是RAPD分析的群體內樣本量過少造成的。并提出優先保護與其他群體差異較大的遵義群體，而神農架半野生群體應進行遷地保護，以保證種內高水平的遺傳多樣性^[56]。

2.2.3 性別相關分子標記

杜仲為嚴格的雌雄異株植物，不同性別的杜仲植株在經濟價值和實際利用方面有很大差別。在幼年期僅憑形態學特征難以辨別其性別，給杜仲品種改良和保護工作帶來困難。北京大學、西北農林科技大學分別利用RAPD、AFLP標記結合BSA（bulk segregant analysis）法對杜仲性別相關分子標記進行了篩選和驗證；分別得到1個 569 bp 的雌性特有的RAPD標記和1個350 bp 的雄性特有的AFLP標記，并將這2個標記轉化成簡單、穩定的SCAR標記。經反復驗證，確定這2個SCAR標記可用于杜仲分子標記輔助育種，可用于杜仲后代在苗期進行性別快速選擇，大幅提高育種效率^[57-58]。

2.2.4 遺傳連鎖圖譜構建及QTL定位

西北農林科技大學利用AFLP標記技術和擬測交作圖策略，以人工雜交獲得的F1作圖群體為材料，構建了首張杜仲分子遺傳連鎖圖譜。親本Q1遺傳連鎖圖包括12個連鎖群108個標記，覆蓋基因組總長929.57 cM，相鄰標記的平均間距為8.61 cM。親本LF遺傳連鎖圖包括14個連鎖群127個標記，覆蓋LF基因組總長約1 116.08 cM，連鎖圖上相鄰標記間的平均距離為 8.78 cM。在此遺傳連鎖圖譜的基礎上利用F1作圖群體的表型數據分析結果，對杜仲生長性狀和葉片性狀進行了QTL定位，共檢測到控制8個性狀的29個QTL位點^[59]。遺傳連鎖圖譜的構建為今后杜仲分子遺傳改良及分子標記輔助育種奠定了堅實基礎。

2.2.5 功能基因研究

杜仲功能基因研究也取得了一定進展。貴州大學以杜仲幼嫩樹皮為材料，采用RT-PCR技術構建了杜仲樹皮的cDNA文庫^[60]。在此基礎上又分離出杜仲膠顆粒結合蛋白EuRPP，并證明EuRPP存在于含膠細胞中，可能參與杜仲膠的形成過程^[61-62]。隨著一個新的杜仲抗真菌蛋白EAFP3被發現，EuRPP的氨基酸序列也得到鑒定，其具有與EAFP3相同的抗菌功能也能得到證明^[63]。目前已經成功克隆出的杜仲膠合成相關基因還有EuFPS、杜仲肉桂醇脫氫酶基因和杜仲3-羥基-3-甲基戊二酸單酞輔酶A還原酶基因^[64-66]。近年來隨著第2代測序技術的發展，轉錄組測序分析已經成為發掘功能基因的主流方法。中南林業科技大學對杜仲葉片和果實的轉錄組數據進行了深度分析，得到了果實和葉片差異表達基因和特異表達基因信息，以及杜仲膠、α-亞麻酸、苯丙素類等活性物質生物合成途徑的相關基因表達規律及關鍵酶基因信息；分別發現杜仲膠合成上游、下游相關基因124、74條，篩選出杜仲膠合成上游和下游包括乳膠管蛋白、橡膠延伸因子、橡膠小顆粒蛋白和杜仲膠合成關鍵酶基因異戊二烯磷酸二合酶等關鍵酶基因63條^[67-69]。

2.2.6 轉基因研究

功能基因的大量發掘為杜仲的轉基因育種奠定了基礎。貴州大學采用農桿菌介導法對杜仲進行了遺傳轉化，構建了杜仲膠合成基因的RNA干擾表達載體和過量表達載體，建立了杜仲遺傳轉化體系^[70-71]。將杜仲膠合成基因成功轉入煙草，得到了轉基因植株，證明EuFPS基因參與了煙草揮發性成分等萜類物質的調控^[72]，且發現轉基因植株的杜仲膠含量提高了18.65%～26.54%^[69]。

3 研究展望

近年來，我國在杜仲常規育種和生物技術育種工作中均取得了一定成就，但活性成分提取、藥理等方面的研究還相對薄弱。常規育種方面，研究部門充分利用當地種質資源選育出一批杜仲優良品種和優良無性系，為杜仲的產業化發展奠定了堅實基礎。

生物技術育種方面，分子標記技術已經在杜仲育種研究中得到大量應用，第1張杜仲分子標記遺傳連鎖圖譜已經被成功構建，但所構建的遺傳圖譜密度中等，雖能夠用于杜仲重要性狀定位，但距離飽和差距還較大，無法進行精細定位，離圖位克隆仍有一定距離。為了高效、精準對杜仲重要經濟性狀進行定位，還須進一步建立其高密度連鎖圖。隨著大量功能基因被發掘，杜仲轉基因育種方面的研究也在不斷完善，杜仲遺傳轉化體系已經建立，而且成功獲得了高膠含量的轉基因植株，為大幅度提高杜仲膠含量奠定了基礎。隨著更多功能基因被不斷發掘，轉基因技術在杜仲育種中一定會扮演更加重要的角色。

杜仲生長周期長，生長環境較難控制，是杜仲遺傳改良研究中最主要的限制因素。由于杜仲遺傳基礎研究比較薄弱，對其許多經濟性狀的早期選擇和高效遺傳改良等問題仍無法從根本上得到解決，從而制約杜仲良種選育工作進程。因此，尋找有效的早期選擇方法，提高選擇效率，縮短育種周期，對杜仲育種工作具有十分重要的意義。

總的說來，如何進一步選育出速生、豐產、有效成分含量高的新品種仍是今后杜仲育種工作的重要目標。今后應根據生產和產業化發展的需求，將常規育種與生物技術育種緊密結合，選育出更多具有廣闊產業化前景的優良品種。

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