集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統

趙樹彌+朱靈+朱燦燦等

摘要集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統將核酸提取、PCR擴增與實時熒光檢測進行整合，在同一塊微流控芯片上實現了核酸分析過程的全自動和全封閉，具有試劑用量少、分析速度快、操作簡便等優點。本研究采用微機械加工技術制作集成核酸提取微流控芯片的陽極模，使用組合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片，與玻璃基底通過等離子體鍵合封裝成集成核酸提取芯片。構建了由微流體速度可調節（0～10 mL/min）的驅動控制裝置、溫控精度可達0.1 ℃的TEC溫控平臺、CCD檢測功能模塊等組成的微全分析系統。以人類血液裂解液為樣品，采用硅膠膜進行芯片上核酸提取。系統根據設置好的時序自動執行，以2 mL/min的流體驅動速度完成20 μL裂解液上樣、清洗； 以1 mL/min的流體驅動速度完成DNA洗脫，抽取PCR試劑與之混合注入到反應腔。提取的基因組DNA以鏈上內參基因GAPDH為檢測對象，并以傳統手工提取為對照，在該系統平臺上進行PCR擴增和熔解曲線分析實驗。片上PCR擴增結果顯示，擴增曲線明顯，Ct值分別為25.3和26.9。擴增產物進行熔解曲線分析得到的熔解溫度一致，均為89.9 ℃。結果表明，此系統能夠自動化、全封閉的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR擴增與實時定量分析。關鍵詞核酸提取； 微全分析系統； 實時熒光PCR； 微流控芯片

核酸作為基本的遺傳物質，攜帶著各種信息，對其結構、功能的認識，有利于研究物種的遺傳、進化以及疾病診斷等[1]。微流控芯片在核酸分析方面有著廣泛和極其重要的應用，如基因突變檢測[2]、病原體基因鑒定[3，4]、SNP（Single nucleotide polymorphism）分析[5]等。傳統的PCR（Polymerase chain reaction）技術雖然能實現DNA的擴增檢測，但其檢測結果受人為因素的影響較大，需要專業技術人員和實驗室設備，而熒光定量PCR技術和微流控技術的相結合，能實現核酸操作過程的自動化、全封閉，簡化了人工的操作過程，避免了過程污染，提高了核酸檢測的效率和準確性[6～8]。集成核酸提取功能的實時熒光PCR微全分析系統將樣品前處理、PCR擴增與熒光檢測功能模塊集成，能直接給出分析結果，可實現“樣品進結果出”這一目標。因此，微全分析系統現已成為分析儀器和分析科學發展的重要方向和前沿[9～11]。

集成化的微流控芯片通常將微流體控制與分析單元集成在芯片上，如微泵、微閥、微加熱器、微混合器、微流量控制器以及微檢測器等，使體積微型化和功能集成化，在較短時間內精確完成從樣品制備到結果顯示的全部過程[12～14]。盡管大規模集成的微全分析系統還處在實驗室研究階段，但隨著微流控芯片的運用與發展[15～17]，針對特定功能的微流控芯片及系統發展迅速[18，19]，如靜態腔式微流控PCR系統[20]、具有樣品前處理功能的核酸提取系統[21，22]、集成化的溫控系統[23]、微型化的檢測系統[24]。目前，由于各功能模塊的研究突破，促進了集成化的發展，但形成一個完整的集成化系統還存在著很大的技術難度[25，19]。

本實驗基于固相萃取法[26]，采用硅膠膜提取核酸[27]，設計并制作了集成核酸提取的微流控芯片。使用自主研發的實時熒光PCR微全分析系統，成功提取了人全血中的基因組DNA，對基因組上穩定表達的內參基因甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH）進行PCR擴增檢測。開展了傳統手工提取核酸的對照試驗，通過對比，驗證了集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統的可行性，實現了在同一塊微流控芯片上完成核酸的提取與分析過程。2實驗部分

2.1芯片設計與制作

通過微機械加工技術[28]在一個很小體積的金屬塊上加工各種微小型腔體，然后把它們作為一個鑲塊嵌入模板并進行整體組裝，組裝成的模具示意圖如圖1A所示，模具尺寸為40 mm×50 mm×10 mm，制作芯片的實物如圖1B所示。C1是Buffer Aw1試劑腔，C2是Buffer Aw2試劑腔，C4是AE試劑腔，C5是PCR反應試劑腔，C1～C3的體積均為110 μL，C4～C6的體積均為50 μL；E是50 μL的提取腔；W是224 μL的廢液腔；M是50 μL的混合腔；扁平形的PCR反應腔體積為20 μL。

圖1模具示意圖（A）和集成核酸提取芯片（B）

Fig.1Schematic diagram of chip mold （A） and integrated DNA extraction chip （B）核酸提取芯片的制作采用模具組合法[29，30]生成，這不僅便于微小型腔的微細加工和鑲塊的更換，而且能夠提高模具整體的使用壽命。嵌入體在PDMS膠水（Sylgard 184， DowCorning）中構成3D結構，這種3D的通道可以像立交橋分層相互獨立貫穿整個空間，實現了真正意義上的3D通道。固化后的PDMS 表面具有一定的粘附力， 可借助分子間的引力自然與玻璃基板進行粘合， 但這種粘合強度有限， 容易發生漏液。本研究采用氧等離子體鍵合的方法[31]處理PDMS 芯片與玻璃基片35 s，改善了PDMS和玻璃表面活性，然后貼合放置在90 ℃的恒溫箱烘烤30 min，使芯片成為永久性粘合。分 析 化 學第42卷第10期趙樹彌等： 集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統

2.2芯片的驅動控制

微機械加工技術在芯片上制備出精細和復雜的幾何通道結構，可利用通道自身特性和特征進行微流體的流動控制[32]。由于微通道中表面積與體積之比非常大，表面效應極大影響流體流動，給微流體驅動和控制帶來了困難。芯片上的操作過程包括細胞裂解液加載，硅膠膜上DNA吸附、清洗、洗脫，反應試劑的混合以及PCR反應。在對微流體特性進行深入分析的基礎上，開發了一套相應的驅動控制裝置。硬件設備主要包括FPGA核心電路板、陣列電磁閥、氣體質量流量控制器、微型真空泵。陣列電磁閥上配置壓力傳感器和減壓閥；微真空泵的最大真空度為60 kPa， 最大流速為15 L/min；氣體質量流量控制器的對流體的流速控制范圍在0～10 mL/min。FPGA電路控制陣列電磁閥為芯片上流體的操控提供時序控制， 外置氣動泵和流量控制器對微流體進行可調節的驅動和控制。

2.3實時熒光PCR分析裝置

實時熒光定量PCR分析裝置集成了三大功能模塊： 工控機、CCD熒光檢測模塊和半導體溫控模塊，如圖2A所示。工控機控制系統是分析平臺的操控中心，不僅協調各模塊的操作控制，還對數據進行處理分析。CCD熒光檢測模塊的總體性能將影響整個分析系統的檢出限、檢測速度、適用范圍等指標[24]， 其結構如圖2B所示，主要由微流控芯片、LED光源、CCD探測器三部分組成。CCD探測器性能以熒光素鈉模擬測試達到了5×1010mol/L，實現了高靈敏度的探測。溫控是PCR正常進行的關鍵，溫控的準確性決定了PCR擴增的成敗。本實驗采用半導體制冷器（TEC）來控制微流控PCR芯片的溫度，通過PID算法[33]來實現溫度循環的快速準確控制，溫控平臺如圖2C所示。PCR溫控系統升溫速率為7.2 ℃/s，降溫速率為5 ℃/s，溫控精度達到了0.1 ℃，完全能夠滿足PCR溫度控制的需求。本實驗制作的PDMS基片厚度為7.5 mm，PDMS材料本身導熱性差，使得腔內反應溫度不受外界影響。腔內的溫度變化主要通過玻璃與TEC熱交換實現。反應腔的體積為20 μL，屬于大體系下的PCR反應[20]。PCR實驗中，反應溫度設置均低于水的沸點，腔內水分快速蒸發滲透到外表面難以發生。

2.5實驗方法

血液按照裂解試劑盒（QIAamp DNA Micro Kit）說明書進行裂解，然后將裂解過的血溶液（20 μL）加載到微流控芯片上，啟動微全分析系統。手工提取核酸使用離心機按照試劑盒標準提取方法進行[27]。提取完成之后取約為2 μL DNA原液與20 μL PCR反應試劑混合，注入到芯片的PCR反應腔進行擴增檢測。無論是芯片上自動提取的核酸，還是手工提取的核酸，擴增檢測均使用同一條件。根據所選的基因片段設置反應所需要的條件：預變性階段95 ℃保持160 s后直接進入循環擴增階段；95 ℃保持15 s，降溫至60 ℃保持40 s，然后在72 ℃保持60 s，執行40次循環；設置熔解的升溫步長為1 ℃/s， 每個步長保持時間為5 s。儀器根據設置好的參數進行PCR擴增檢測，給出分析結果。

3結果與討論

3.1微流體驅動與控制分析

集成核酸提取的PCR芯片流體通道為200～500 μm之間，提取過程中微流體在不同尺度的微通道內多次交替，要求流體的驅動力不同，因此，微流體的驅動和控制尤其顯得困難。這種流動特性的變化使得宏觀流體驅動與控制技術在微流體中的簡單移植往往不成功或者效果不好。本研究根據集成核酸提取的微流控芯片的驅動和控制要求，對于裂解液的廢液抽取，Buffer Aw1、Buffer Aw2的驅動均采用2 mL/min的速度控制。 對于洗脫液AE、PCR反應試劑驅動，PCR反應腔溶液的注入均采用1 mL/min的速度控制。氣體流量控制器根據不同時段、不同量的驅動，采用不同的驅動參數，實現可變的控制，滿足了實驗過程中的微流體運動的控制和驅動。

3.2核酸提取過程分析

芯片上核酸提取過程的原理如圖3所示。在實物圖中，C0是提取腔里的一部分，提取腔E底層為微通道連接，中間層是硅膠膜，上層是血液加載腔；V1～V8是微閥連接微泵的通道，+號表示往管道施加正壓；號是表示施加負壓，氣路處于抽取空氣狀態。芯片上的操作過程包括FPGA控制系統首先啟動1號和5號電磁閥，抽取裂解液中的廢液至廢液腔；其次啟動2號電磁閥，氣動驅動50 μL Buffer Aw1到吸附柱中，洗滌DNA中雜質；30 s后啟動5號電磁閥抽取廢液；廢液排空后，啟動3號電磁閥，驅動50 μL Buffer Aw2到吸附柱中，再次洗滌DNA中雜質；30 s后再次啟動5號電磁閥抽取廢液；待洗滌液除盡后，繼續抽吸吸附柱，直到吸附膜干燥后關閉；啟動4號電磁閥，加入10 μL AE到吸附柱中，洗脫DNA，打開7號電磁閥抽約2 μL至混合腔；啟動6號電磁閥，推入PCR反應試劑20 μL到混合腔；最后啟動8號電磁閥，抽取混合腔溶液至PCR反應腔，對PCR反應腔兩端進行密封，即可開始PCR擴增與熔解檢測分析。

Fig.3Schematic diagrams of nucleic acid extraction提取腔中的硅膠膜具有在高鹽低pH條件下能吸附DNA，低鹽高pH條件下釋放DNA的特性。在提取過程中通過Buffer Aw1的沖洗作用去除硅膠膜上吸附的蛋白、脂質等雜質，以獲得高質量基因組DNA；通過Buffer Aw2的沖洗作用去除殘留乙醇，避免影響后續的酶促反應（PCR或酶切）；通過洗脫液TE的作用將膜上結合的DNA洗脫至溶液中，同時利于基因組DNA 充分溶解。混合腔利用重力溶合PCR試劑和DNA溶液，經過S通道又進一步混合[34]。整個DNA的提取到PCR反應，過程操作快速、簡便。

3.3核酸的擴增檢測分析

對于提取的DNA通過PCR擴增進行檢測，首先加熱使DNA雙鏈在95℃解鏈變為兩條單鏈，然后降溫至延伸階段，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則，DNA單鏈合成雙鏈，數量成倍增加，實現DNA的指數擴增。SYBR Green熒光染料能與DNA雙鏈結合，通過中心波長約為497 nm的LED激發光激發能夠發出波長約為520 nm的熒光[35]。在延伸期，利用CCD檢測熒光信號的強度，就能實現DNA序列擴增量的實時監測。因此，在PCR擴增體系內，熒光信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。本研究針對提取的DNA鏈上的GAPDH基因，自行設計引物，進行了PCR擴增與熔解曲線分析。通過分析GAPDH基因的檢測結果，可以對DNA提取效率以及提取質量加以判別分析。

本研究對兩種提取方法進行了對比實驗。在圖4中曲線1、2為手工提取核酸的擴增曲線，曲線3、4為芯片上自動提取核酸的擴增曲線。從圖4A可見，手工提取與芯片法提取的DNA鏈上的GAPDH基因在PCR反應后均獲得了明顯的擴增，手工提取法的Ct值（反應腔內熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數）分別是22.5和23.0， 芯片法的Ct值分別為25.3和26.9，結果表明均實現了基因組DNA的提取與GAPDH基因的擴增檢測。從熔解曲線圖4B可見，均有統一的熔解溫度值89.9℃，表明了芯片法提取結果的準確性。由于手工提取與芯片自動提取使用的裂解液量與洗脫液量比例不同，提取的DNA濃度有差異，所以擴增曲線不完全重合。但是從熔解曲線可以看出，單一的熔解峰，相一致的熔解溫度值表明了擴增產物是來自基因組DNA的同一個基因片段，而且提取的基因組DNA純度高、質量好。

4結論

本實驗成功研制了集成核酸提取的PCR芯片以及芯片的驅動控制、檢測、分析系統，并成功地從人體全血的裂解液中提取了基因組DNA，并進行了GAPDH基因的擴增與檢測，通過實驗對比驗證了系統的可行性與結果的正確性。芯片上核酸提取使用的試劑量幾乎是傳統法的1/10，而且全自動化、全封閉的操作，大大改善了傳統操作技術耗時長、試劑消耗量大、操作步驟繁瑣、操作過程易受污染等缺點。本研究使得集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統本身具有的快速、高靈敏度、低消耗、易于集成化、便攜化的獨特優勢更好、更充分的發揮出來，提高了微流控芯片的自動化操作水平。

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