飼料中添加芽孢桿菌對方斑東風螺抗氧化酶活性的影響初步研究

王 茜，孫海彥，方 哲，陳 江，王春吉，王冬梅

（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 中國熱帶農業科學院熱帶海洋生物資源利用研究中心，海南海口 571101）

方斑東風螺（Babylonia areolata）主要分布于我國東南沿海和東南亞諸國亞熱帶及熱帶沿海，其味道鮮美、營養價值高，隨著規?；斯び绾宛B殖技術的成功，我國東風螺養殖業發展前景良好。但目前東風螺的養殖主要采用小雜魚為餌料，存在餌料供應不穩定、養殖水體污染及致病性細菌侵染等問題，直接制約了東風螺養殖的規模和可持續發展。

飼用微生物制劑是利用特殊工藝將對動物有益的微生物制成的活菌劑，其作用之一是能夠刺激動物的免疫系統，提高其免疫力。本試驗以芽孢桿菌為配合飼料微生物添加劑，研究地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對方斑東風螺抗氧化酶活性的影響，為生產免疫功能性東風螺配合飼料提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 基礎飼料配制以魚粉、豆粕為主要的蛋白源，魚油為主要的脂肪源，α-淀粉為飼料黏合劑，飼料組成見表1。芽孢桿菌粉由本所提供，含菌量為0.2%。以不添加芽孢桿菌的基礎飼料作為對照（C組），試驗組在基礎飼料中分別添加0.5%的枯草芽孢桿菌粉和0.5%的地衣芽孢桿菌粉，分別編號為K組和D組。將固體原料粉碎后過80目篩，然后按照配方稱取原料，用飼料混合機混合均勻。按照配方加入魚油和水混合揉成面團狀，稱重記錄，再按照估算的日投喂量分成小塊，裝入封口袋。為保證飼料成分一致，所有試驗飼料一次制備，保存于-20℃，投喂前使之解凍至室溫。

表1 試驗飼料組成 %

1.2 飼養管理 試驗于2012年12月至2013年2月在中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所海洋動物實驗室進行。方斑東風螺幼螺由瓊海市長坡鎮昌旺東風螺養殖場提供，選擇同一批螺苗，暫養馴化1周，停止投喂2 d后，挑選活力好、個體規格相近，體重為（1.9±0.2）g的個體作為試驗材料，隨機分配至對照組和2個試驗組，每組3個重復。在37 cm×25 cm×30 cm的水族箱中，鋪一層60目絹布，布上鋪3～4 cm的細沙，加入天然海水，采用循環水飼養。養殖期間海水鹽度為33‰，pH 為 7.6，水溫為（23±1.2）℃，隔天投餌一次，1 h后清除殘餌，養殖60 d后取樣。

1.3 樣品處理與測定 每組中各隨機選取3只，共9只，每只螺組織單獨測定。每次取樣后立即于冰上解剖分離出肝胰臟，用預冷的生理鹽水清洗，再用濾紙吸干，準確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成 10%的組織勻漿，4℃、2500 r/min離心 10 min，取上清液用于酶活測定，所有樣品在24 h內測定完畢。

組織勻漿粗提液蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定。超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行。酶活力單位定義如下：

SOD活力單位：每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量，為一個 SOD活力單位（U）。

CAT活力單位：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的 H2O2的量為一個活力單位（U）。

POD活力單位：在37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產生1 μg的底物的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.4 統計分析 數據均以 “平均值±標準誤”表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據分析，用單因素方差分析法 （ANOVA）進行比較，P≤0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌對方斑東風螺肝胰臟中SOD活力的影響 由圖1可見，C組SOD平均活力為（24.67±4.3）U/mg prot，K 組和 D 組分別為（23.38±2.05）U/mg prot和（17.05±3.22）U/mg prot。 經統計分析，K組與C組差異不顯著（P＞0.05），說明飼料中添加枯草芽孢桿菌不影響方斑東風螺肝胰臟組織中SOD的活力；而D組SOD的活力相對于空白對照的C組降低了30.89%，差異極顯著（P＜0.01），說明飼料中添加地衣芽孢桿菌可引起方斑東風螺肝胰臟組織中SOD的活力降低。

圖1 芽孢桿菌對方斑東風螺肝胰臟中SOD活力的影響

2.2 芽孢桿菌對方斑東風螺肝胰臟中CAT活力的影響 由圖2可見，C、K、D組CAT平均活力分別為（0.91±0.46）、（0.89±0.44）U/mg prot和（0.27±0.35）U/mg prot。地衣芽孢桿菌顯著降低了方斑東風螺肝胰臟中CAT的活力（P＜0.05），比對照組降低了70.33%；添加枯草芽孢桿菌的K組方斑東風螺肝胰臟中CAT的活力與對照組無顯著差異（P＞0.05）。說明飼料中添加枯草芽孢桿菌不影響方斑東風螺肝胰臟組織中CAT的活力，添加地衣芽孢桿菌可引起方斑東風螺肝胰臟組織中CAT的活力降低。

圖2 芽孢桿菌對方斑東風螺肝胰臟中CAT活力的影響

2.3 芽孢桿菌對方斑東風螺肝胰臟中POD活力的影響 由圖3可見，與SOD和CAT不同，飼料中添加枯草芽孢桿菌的K組方斑東風螺肝胰臟中 POD 的平均活力為（4.2±0.78）U/mg prot，而對照組為（3.27±0.49）U/mg prot，與對照組的活力相比提高了28.44%（P＜0.05）；添加地衣芽孢桿菌的D組方斑東風螺肝胰臟中POD的活力為（3.41±0.62）U/mg prot，與對照組相比無顯著變化（P＞0.05）。說明飼料中添加枯草芽孢桿菌可引起方斑東風螺肝胰臟組織中CAT的活力升高，添加地衣芽孢桿菌不影響方斑東風螺肝胰臟組織中POD的活力。

圖3 芽孢桿菌對方斑東風螺肝胰臟中POD活力的影響

3 討論

方斑東風螺屬于無脊椎動物的新腹足類，僅有非特異性免疫系統，可分為體液免疫和細胞免疫兩個部分，由血細胞分泌的抗氧化酶，被認為是體液免疫的重要組成部分（Ordasd等，2000）。動物體由于呼吸爆發而產生活性氧，一方面具有殺菌功能，另一方面也會對機體自身造成傷害，而抗氧化酶在清除自由基的過程中發揮重要的作用，從而能防止機體受到氧化破壞。SOD、CAT、POD是機體分解H2O2及清除等自由基的重要酶類。已有研究表明，肝胰臟是東風螺對抗饑餓、污染等脅迫環境的重要器官，肝胰臟抗氧化酶的活性水平與免疫防御能力密切相關（薛明等，2010）。

芽孢桿菌作為微生態制劑，在養殖生產中已廣泛使用，并取得了較好的效果。在魚、蝦、貝等水產動物的研究中發現，芽孢桿菌可以提高其免疫器官的抗氧化能力和免疫功能。對草魚的研究發現，飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高草魚血清和肝胰臟中SOD和CAT的活性 （沈文英等，2011）。而在飼料中添加枯草芽孢桿菌對凡納濱對蝦血清SOD的活性無顯著影響 （王玲等，2011）。本研究以芽孢桿菌作為飼料添加劑，對方斑東風螺肝胰臟組織中SOD、CAT和POD三種酶活性進行分析，結果表明，在飼料中添加0.5%的枯草芽孢桿菌添加劑，對東風螺肝胰臟組織中SOD和CAT的活性無顯著影響，但能顯著提高POD的活性；而飼料中添加0.5%地衣芽孢桿菌則顯著降低了東風螺肝胰臟組織中SOD和CAT的活性，對POD的活性無顯著影響。雖然芽孢桿菌作為飼料添加劑已被廣泛應用于禽畜和水產動物的養殖，但由于養殖對象自身的特性不同，應用效果和適宜添加量也不同。根據本試驗的結果，飼料中添加0.5%的枯草芽孢桿菌可提高方斑東風螺的非特異性免疫力，反之，飼料中添加0.5%的地衣芽孢桿菌可能會降低方斑東風螺的非特異性免疫力。

[1]沈文英，李衛芬，梁權，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚生長性能、免疫和抗氧化能力的影響[J].動物營養學報，2011，23（5）：881 ～ 886.

[2]王玲，張春曉，孫鳴，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌（CGMCC No.3755）對凡納濱對蝦生長性能和非特異性免疫力的影響[J].飼料工業，2011，4（32）：47～51.

[3]薛明，柯才煥，王德祥，等.饑餓及恢復生長對方斑東風螺抗氧化體系的影響[J].中國水產科學，2010，2（17）：281 ～ 288.

[4]Ordas M C，Ordas A，Beloso C，et al.Immune parameters in carpet shell clams naturally infected with Perkinsus atlanticus[J].Fish&Shellfish Immunology，2000，10：597 ～ 609.■