中華劍角蝗共生真菌Penicillium oxalicum中苯并吡喃酮二聚體類化合物的研究

徐 幫，鄒 坤，郭玲芝，劉呈雄，程 凡

三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，宜昌 443002

昆蟲是生物界種類數量最多的類群，約占全球生物多樣性的一半。昆蟲與微生物的共生是一種普遍的現象，其種類之多、數量之大及分布之廣則意味著昆蟲共生菌有豐富的多樣性，源自其中的共生真菌可能會產生結構新穎，類型豐富的活性次級代謝產物，因而昆蟲共生真菌已成為尋找新生物活性物質的新的重要來源［1］。但目前，人們對昆蟲共生菌研究的很少，對其代謝產物研究更少。

本文作者從中華劍角蝗的腸道中分離得到一株草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，對其發酵產物進行了化學研究，從中分離得到6個化合物，通過波譜數據分析及理化性質鑒定了它們的結構，確定為苯并吡喃酮二聚體類化合物，所有化合物均為首次從該屬菌種中分離得到。采用MTT法進行了細胞毒活性的測試，結果發現化合物1對人體肝癌細胞Hep G2具有顯著的細胞毒活性，其IC50值為1.1 μM。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司;AmozonSL+1200液相色譜-雙重漏斗傳輸離子阱質譜儀，德國布魯克·道爾頓公司;Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司;Cosmosil MS-II RP-C18色譜柱(5 μm，250 ×10 mm 半制備型;5 μm，250×4.6 mm 分析型);低溫冷凍干燥機，美國Labconco公司;WZZ-2S數字式自動旋光儀，上海精科;薄層色譜硅膠GF254，青島海洋化工有限公司;正相色譜硅膠，煙臺化學工業研究所;反相色譜硅膠，日本 YMC公司;Sephadex LH-20，美國Pharmacia公司;除了分析和制備用的色譜純乙腈外，其它試劑均為分析純。

1.2 菌株和細胞株

實驗菌株分離自中華劍角蝗腸道，昆蟲樣品于2011年7月采集于湖北省神農架大九湖國家濕地公園，菌株由三峽大學涂璇博士鑒定為草酸青霉(Penicillium oxalicum)，保存于三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室;人肝癌細胞Hep G2購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，由三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室傳代保藏。

1.3 培養基

培養基:SDA培養基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH值自然);SD培養基(葡萄糖40 g，蛋白胨 10 g，水 1000 mL，pH 值自然)，1.25×105Pa滅菌20 min。

1.4 菌株Penicillium oxalicum的發酵

菌株經SDA培養基斜面活化后，接種于SD種子培養基中，于28℃、125 rpm振蕩培養3 d;將培養好的種子以5%的接種量接種于SD發酵培養基中，于28℃、125 rpm振蕩培養16 d，共發酵40 L。

1.5 細胞毒活性的測試——MTT法［2］

培養細胞按1×105個/mL的密度種植于96孔培養板中，37℃、5%CO2培養箱中培養12 h，將待測藥物配制成6個濃度梯度，加入到96孔培養板中，每個濃度梯度設6個復孔，并設置空白孔(含細胞的培養液+MTT+DMSO)、陽性藥物孔(含細胞的培養液+25 μg/mL絲裂霉素+MTT+DMSO)及調零孔(培養液+MTT+DMSO)。繼續培養24 h、48 h、72 h后，于每孔中加入20 μL的 MTT試劑(5 mg/mL)顯色，繼續培養4 h，吸出孔內的培養液，于每孔中加入150 μL的DMSO，震蕩搖勻10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀490 nm波長下測其OD值，按公式計算抑制率。計算公式:生長抑制率(%)=(1-藥物孔OD/空白孔OD)×100%。采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，計算半數抑制濃度(IC50)值。

2 提取與分離

發酵液40 L過濾，用乙酸乙脂萃取濾液，減壓濃縮得12.2 g粗提物;菌絲體經37℃烘干處理后，用氯仿-甲醇(1∶1)浸提烘干的菌絲體，過濾，上清液減壓濃縮得10.6 g粗提物。將上述粗提物合并，經正相硅膠柱色譜(800 g正相硅膠，200～300目)分離，氯仿-甲醇(100∶0 ～50∶50%，v/v)梯度洗脫，得5個洗脫部分(Ⅰ～Ⅴ)。Ⅰ部分中的流分Fr.2析出黃色晶體化合物1(36.6 mg)。取Ⅱ部分6.3 g，經加壓反相硅膠柱色譜分離，以乙腈-水(30∶70～100∶0，v/v)梯度洗脫，合并流分 Fr.23-25，經反相HPLC 制備，乙腈-水(48∶52，v/v)洗脫，得到化合物2(15.3 mg)，化合物4(5.2 mg)，化合物 5(9.4 mg)。合并流分Fr.26-29，經反相HPLC制備，乙腈-水(68∶32，v/v)洗脫，得到化合物 3(4.2 mg)，化合物6(8.6 mg)。

圖1 化合物1～6的化學結構Fig.1 Structures of Compound 1-6

3 結構鑒定

化合物1 黃色針晶;ESI-MS m/z:639［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:13.78(2H，s，8，8'-OH)，11.74(2H，s，1，1'-OH)，7.45(2H，d，J=8.5Hz，H-3，3')，6.63(2H，d，J=8.5 Hz，H-4，4')，3.93(2H，d，J=11 Hz，H-5，5')，3.72(6H，s，13，13'-OCH3)，2.73(2H，dd，J=6.0，19.1 Hz，H-7a，7a')，2.41(2H，m，H-6，6')，2.31(2H，dd，J=10.5，19.2 Hz，H-7b，7b')，1.17(6H，d，J=6.6 Hz，H-11，11');13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:187.2(C-9，9')，177.5(C-8，8')，170.3(C-12，12')，159.4(C-1，1')，158.3(C-4a，4a')，140.2(C-3，3')，117.3(C-2，2')，107.5(C-4，4')，106.3(C-9a，9a')，101.7(C-8a，8a')，84.7(C-10a，10a')，77.0(C-5，5')，53.2(13，13'-OCH3)，36.3(C-7，7')，29.3(C-6，6')，18.0(C-11，11')。結合文獻報道［3-5］的波譜數據，化合物1可能是secalonic acid A(SAA)或secalonic acid D(SAD)，兩者不同之處在于 5、6、10a 和 5'、6'、10a'位羥基構型不同。通過測定比旋光度與文獻值相比較，化合物1的比旋光度［α］-73.3°(c=0.10，氯仿)，文獻中，SAD 的比旋光度［α］+88°(c=0.10，氯仿)［3，5］，SAA 的比旋光度［α］20D-75°(c=0.10，氯仿)［4］。最終鑒定化合物 1 為 secalonic acid A。

化合物2 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+1］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:15.34(1H，s，5'-OH)，12.76(1H，s，5-OH)，10.14(1H，s，OH-8)，7.14(1H，s，H-7)，7.01(1H，s，H-6)，6.42(1H，d，J=2.3 Hz，H-7')，6.34(1H，s，H-3)，6.24(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.02(1H，s，H-3')，4.00(3H，s，6'-OCH3)，3.65(3H，s，8'-OCH3)，3.44(3H，s，10-OCH3)，2.48(3H，s，2-CH3)，2.16(3H，s，2'-CH3);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:184.2(C-4')，182.8(C-4)，167.7(C-2')，166.6(C-2)，165.9(C-5')，164.0(C-8')，162.5(C-6')，161.5(C-8)，157.2(C-10)，156.5(C-5)，156.2(C-10b)，152.0(C-10a')，140.9(C-6a)，140.7(C-9a')，116.0(C-9)，110.8(C-3)，109.4(C-4a)，108.0(C-5a')，107.6(C-3')，105.9(C-10a)，105.6(C-7)，104.6(C-10')，104.3(C-6)，101.6(C-4a')，97.5(C-9')，95.7(C-7')，61.3(10-OCH3)，56.2(6'-OCH3)，55.3(8'-OCH3)，20.7(2'-CH3)，20.5(2-CH3)。以上數據與文獻［6］報道一致，故鑒定化合物2為asperpyrones A。

化合物3 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:571［M+1］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:13.21(1H，s，5'-OH)，12.95(1H，s，5-OH)，7.29(1H，s，H-6)，7.12(1H，s，H-7)，6.63(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.56(1H，s，H-3')，6.54(1H，s，H-3)，6.10(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，4.01(3H，s，10'-OCH3)，3.74(3H，s，8-OCH3)，3.59(3H，s，8'-OCH3)，3.46(3H，s，10-OCH3)，2.56(3H，s，2'-CH3)，2.48(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:182.4(C-4')，182.3(C-4)，168.2(C-2)，167.8(C-2')，161.1(C-8')，159.6(C-8)，159.3(C-10')，156.2(C-10)，156.1(C-5)，155.6(C-10b')，155.0(C-10b)，153.6(C-5')，140.2(C-6a')，139.9(C-6a)，117.4(C-9)，109.9(C-3)，109.8(C-3')，109.1(C-6')，108.4(C-4a)，107.5(C-4a')，107.3(C-10a)，105.4(C-6)，104.0(C-10a')，101.9(C-7)，96.9(C-9')，96.3(C-7')，60.9(8'-OCH3)，56.3(8-OCH3)，55.9(10'-OCH3)，55.1(10-OCH3)，19.9(CH3-2')，19.8(CH3-2)。以上數據與文獻［6］報道一致，故鑒定化合物3為asperpyrones B。

化合物4 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:569［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ:15.24(1H，s，5-OH)，12.83(1H，s，5'-OH)，7.26(1H，s，H-10)，7.05(1H，s，H-9)，6.43(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.33(1H，s，H-3')，6.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.00(1H，s，H-3)，4.03(3H，s，10'-OCH3)，3.78(3H，s，8-OCH3)，3.61(3H，s，6-OCH3)，3.42(3H，s，8'-OCH3)2.48(3H，s，2'-CH3)，2.12(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.5(C-4)，182.9(C-4')，167.4(C-2)，166.8(C-2')，162.8(C-5)，161.7(C-8')，161.6(C-10')，160.0(C-6)，156.9(C-5')，156.7(C-8)，155.1(C-10b')，150.8(C-10a)，140.8(C-6a')，140.6(C-9a)，117.1(C-7)，110.6(C-5a)，109.4(C-3')，108.6(C-4a')，108.0(C-3)，107.3(C-6')，106.0(C-9)，105.0(C-10a')，104.2(C-4a)，101.5(C-10)，97.0(C-9')，96.3(C-7')，61.2(6-OCH3)，56.1(10'-OCH3)，56.0(8-OCH3)，55.2(8'-OCH3)，20.7(2-CH3)，20.6(2'-CH3)。以上數據與文獻［6］報道一致，故鑒定化合物4為asperpyrone C。

化合物5 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:14.86(1H，s，5-OH)，13.48(1H，s，5'-OH)，7.30(1H，s，H-9)，7.19(1H，s，H-10)，7.11(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.50(1H，s，H-3')，6.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.00(1H，s，H-3)，4.03(3H，s，10'-OCH3)，3.78(3H，s，6-OCH3)，3.61(3H，s，8'-OCH3)，2.48(3H，s，2'-CH3)，2.12(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.5(C-4)，182.7(C-4')，167.6(C-2)，166.9(C-2')，162.3(C-5)，161.7(C-8')，161.6(C-10')，160.0(C-6)，156.9(C-5')，156.7(C-8)，155.1(C-10b')，150.8(C-10a)，140.8(C-6a')，140.6(C-9a)，117.1(C-7)，110.6(C-5a)，109.4(C-3')，108.6(C-4a')，108.0(C-3)，107.3(C-6')，106.0(C-9)，105.0(C-10a')，104.2(C-4a)，101.5(C-10)，97.0(C-9')，96.3(C-7')，61.2(6-OCH3)，56.0(10'-OCH3)，55.1(8'-OCH3)，20.8(2-CH3)，20.5(2'-CH3)。化合物5與化合物4的NMR數據相比較，除了少一個甲氧基以外，其他數據幾乎完全相同。以上數據與文獻［7］報道一致，故鑒定化合物5為asperpyrone D。

化合物6 黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:571［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ:15.25(1H，s，5'-OH)，14.83(1H，s，5-OH)，7.15(1H，s，H-10)，6.97(1H，s，H-9)，6.42(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.21(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.05(1H，s，H-3)，5.98(1H，s，H-3')，4.02(3H，s，6'-OCH3)，3.79(3H，s，8-OCH3)，3.62(3H，s，8'-OCH3)，3.46(3H，s，6-OCH3)，2.42(3H，s，2-CH3)，2.12(3H，s，2'-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.6(C-4')，184.4(C-4)，167.6(C-2)，167.5(C-2')，162.7(C-5')，162.0(C-5)，161.4(C-8')，161.1(C-6')，160.2(C-8)，158.6(C-6)，153.4(C-10a)，150.8(C-10a')，140.7(C-9a)，140.5(C-9a')，117.1(C-7)，111.4(C-5a)，108.6(C-5a')，107.4(C-3)，107.2(C-3')，105.2(C-10')，104.7(C-4a)，104.3(C-4a')，101.3(C-9)，101.2(C-10)，96.9(C-7')，96.5(C-9')，62.0(6-OCH3)，56.2(6'-OCH3)，55.9(8-OCH3)，55.1(8'-OCH3)，20.8(2-CH3)，20.5(2'-CH3)。以上數據與文獻［8］報道一致，故鑒定化合物6為aurasperone A。

4 活性分析

采用MTT法測定化合物對人體肝癌細胞Hep G2的生長抑制作用。實驗結果顯示，化合物1具有顯著的細胞毒活性，其IC50值為1.1 μM。

5 結語

苯并吡喃酮類化合物的單體及二聚體類廣泛分布于黑曲霉和鐮刀屬真菌的次級代謝產物中［9-12］。根據文獻報道，這類化合物對大鼠和小鼠的中樞神經系統表現出急性毒性作用［13］，并且對 Taq DNA聚合酶具有抑制作用［5］。最近研究表明很多來源于真菌次級代謝產物的苯并吡喃酮類化合物都具有一定的抗腫瘤活性，具有十分重要的研究與開發價值，其作用機制更是有待于進一步研究。

1 Zhang YL(張應烙).Microbes associated with Insect– an extensive source of new drug molecules.2011Chinese Medicinal Chemistry Symposium(2011年全國藥物化學學術會議)，2011.

2 Daniel HR，Pradip KB.Isolation and conformational analysis of two conformers of D-Methylalanine-tentoxin.Am Chem Soc，1978，100:2218-2224.

3 Steyn PS.The isolation，structure and configuration of secalonic acid D，the toxic metabolite of Penicillium Oxalicum.Tetrahedon，1970，26:51-57.

4 Steffens JC，Robeson DJ.Secalonic acid A，a vivotoxin in pink root-infected onion.Phytochem．1987，26:1599-1602.

5 Chen L(陳立)，Gu QQ(顧謙群).Studyonthe antitumor metabolites of a sponge-derived fungus，Aspergillus repens.Periodi Ocean Univer China(中國海洋大學學報)，2010，40(5):69-71.

6 Akiyama K，Teraguchi S，Hamasaki Y，et al.New dimeric naphthopyrones from Aspergillus niger.J Nat Prod，2003，66:136-139.

7 Zhan J，Gunaherath GM，Wijeratne EM，et al.Asperpyrone D and other metabolites of the plant-associated fungal strain Aspergillus tubingensis.Phytochem，2007，68:368-372.

8 Campos FR，Barison A，Daolio C，et al.Complete1H and13C NMR assignments of aurasperone A and fonsecinone A，two bis-naphthopyrones produced by Aspergillus aculeatus.Magn Reson Chem，2005，43:962-965.

9 Tanaka H，Wang PL，Yamada O.Yellow pigments of Aspergillus niger and Asp．awamori.I.Isolation of aurasperone A and related pigments.Agric Biol Chem，1966，30:107-113.

10 Wang PL，Tanaka H.Yellow pigments of Aspergillus niger and Aspergillus awamori.II.Chemical structure of aurasperone A.Agric Biol Chem，1966，30:683-687.

11 Tanaka H，Wang PL，Namiki M.Structure of aurasperone C.Agric Biol Chem，1972，36:2511-2517.

12 Priestap HA.New naphthopyrones from Aspergillus fonsecaeus.Tetrahedron，1984，40:3617-3624.

13 Ghosal S，Biswas K，Chakrabarti DK.Toxic naphtho-gammapyrones from Aspergillus niger.J Agric Food Chem，1979，27:1347-1351.