基于SM 蛋白的CHO細胞分泌工程化改造和抗體表達的研究

劉毅華，童梅，劉金毅，徐晨

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基于SM 蛋白的CHO細胞分泌工程化改造和抗體表達的研究

劉毅華，童梅，劉金毅，徐晨

210009 南京，中國藥科大學生命科學與技術學院（劉毅華）；102600 北京三元基因工程有限公司（童梅、劉金毅、徐晨）

通過構建基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO-AV-SM 細胞株，探討在懸浮培養條件下，過表達轉運蛋白 SM 基因對分泌蛋白表達的影響。

首先從人 HEK293FT 細胞中克隆出s1 和18c基因，然后構建含有 SM 基因的真核表達載體 pBSM；隨后將 pBSM 質粒穩定轉染入 CHO-AV 細胞并鑒定，獲得了基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO-AV-SM 細胞株；在此基礎上對 CHO-AV-SM 細胞株進行懸浮培養適應，并測定了 CHO-AV 和 CHO-AV-SM 細胞株的生長和蛋白表達參數。

過表達轉運蛋白 SM 基因，CHO-AV-SM 細胞株的抗體表達量較 CHO-AV 抗體表達量提高約 75%，且測得第 6 天細胞數達到最大值，此時 CHO-AV 的表達量約為 45.4 μg/ml，CHO-AV-SM 的表達量為 79.5 μg/ml。

通過構建全抗穩定表達細胞，在細胞中過表達 SM 基因，并懸浮培養適應，建立了懸浮培養條件下基于轉運蛋白過表達的分泌工程改造方法，為轉運蛋白改造 CHO 細胞，提升全抗表達能力提供了有力支持。

CHO 細胞； 蛋白質工程； SLY1 蛋白質類； MUNC18c蛋白質類； 貝伐單抗

分泌表達是真核細胞表達基因工程重組蛋白的主要表達途徑，在外源基因拷貝數及其轉錄水平達到瓶頸時，提高細胞分泌能力有助于重組蛋白表達量的提升。Sly1/Munc18（SM）蛋白是一類高度保守的囊泡轉運蛋白家族，其中Sly1 調控囊泡由高爾基體至細胞膜的轉運，而Munc18c則調控囊泡由內質網至高爾基體的轉運[1]。已有研究表明在酵母和人細胞中過表達 SM 蛋白能夠提高分泌蛋白的表達量[2]。研究人員把這種基于轉運蛋白過表達的細胞改造稱為“分泌工程化改造”[3]。

本研究從人 HEK293FT 細胞中克隆s1 和18c基因，并構建含有 SM 基因的真核表達載體；然后將構建好的 SM 基因共表達質粒 pBSM 導入以貝伐單抗為報告基因的 CHO-AV 細胞株中，借以構建穩定過表達SM 基因的細胞株CHO-AV-SM。通過運用高通量篩選法獲得外源蛋白表達量較高的工程細胞株，并對工程細胞株進行懸浮培養適應。在此基礎上，通過比較 CHO-AV- SM 細胞與 CHO-AV 細胞在懸浮培養條件下的生長代謝差異，進而驗證 SM 蛋白促進 CHO 細胞分泌表達外源蛋白的功能，并為構建分泌工程化改造細胞確立可行的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 CHO-K1 及 HEK293FT 細胞購自 ATCC；CHO-AV 細胞由北京三元基因工程有限公司構建。

1.1.2 試劑 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶及 PCR 聚合酶購自寶生物工程有限公司；質粒大提、總 DNA、RNA 提取及 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技有限公司；Lipofactamine2000、pBudCE4.1、pcDNA3.1(+) 及 pVITRO2-neo-mcs 質粒、DMEM/F12、CHO 化學限定培養基及胎牛血清購自美國 Invitrogen 公司；pcDNA3.1-AVL（輕鏈）、pcDNA3.1-AVH（重鏈）及 pBSM 質粒由北京三元基因工程有限公司構建；HRP 標記羊抗人 κ 二抗購自美國Southern Biotech 公司；羊抗人 Fc 多抗購自美國KPL 公司。

1.1.3 儀器 PTC-100TM 型 PCR 擴增儀為美國 MJ Research 公司產品；細胞恒溫振蕩培養箱為瑞士Adolf Kuhner AG 公司產品；DSZ5000X 型倒置生物顯微鏡購自重慶澳浦光電技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SM 基因的克隆 收集培養 72 h 的HEK293FT 細胞，細胞計數，用 PBS 洗滌 3 次，參照總 RNA 提取試劑盒說明提取總 RNA，樣品溶解于 50 μl RNase-free ddH2O 中，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 純度，紫外分光光度測定濃度。參照 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書，以獲得的總 RNA 為模板，以 Oligo(dT) 為引物反轉錄合成 cDNA，以 cDNA 作為模板，分別以1 基因的引物1、2 及18c基因的引物18c1、18c2進行 PCR 擴增，擴增產物進行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析，并用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產物分離。切下 1500~2000 bp 之間區域的目的 DNA 片段1 基因和18c基因，并用 DNA 片段回收試劑盒純化線性目的片段。1 及18c基因的上下游引物序列如下：1 上游：5' CCGCTCGAGAC CATGGCGGCGGCGGCGGCAGCG 3'，下游：5' CG CGGATCCTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG 3'；18c1 上游：5' CCGCTCGAGACCATGGC GCCGCCGGTGGCAGAGAGG 3'，下游：5' CGCGG ATCCCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC 3'。

1.2.2 SM 基因共表達載體的構建 分別將上述回收的1 基因和18c基因以I 和H I 進行雙酶切，酶切完成后，用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產物分離，切下 1500 ~2000 bp之間區域的目的 DNA 片段，并用 DNA 片段回收試劑盒純化線性目的片段。使用 T4 DNA 連接酶連接1 基因片段和以II、I 雙酶切的真核表達載體 pBudCE4.1，將獲得的重組質粒轉化 Top10 感受態細胞，挑選測序正確的克隆，并進行質粒提取，得到重組質粒 pBudCE4.1-1命名為 pBS。將真核表達載體 pBudCE4.1 和 pBudCE4.1-1 以H I、I 進行雙酶切，使用 T4 DNA 連接酶連接雙酶切后的18c基因片段和真核表達載體 pBudCE4.1 和 pBudCE4.1-1，將獲得的重組質粒轉化 Top10 感受態細胞，挑選測序正確的克隆，并進行質粒提取，將重組質粒 pBudCE4.1-18c 和 pBudCE4.1-1-18c分別命名為 pBM 和 pBSM。

1.2.3 SM 基因共表達載體轉染 CHO-AV 細胞株 采用 Lipofactamine2000 轉染試劑進行穩定轉染。將 2 × 106個 CHO-AV 細胞接種 T-25 方瓶，當 CHO-AV 細胞密度在 80% ~ 90%時進行轉染。將培養基換成 5 ml 無血清 DMEM/F12 培養基，制備質粒-培養基混合物（質粒 10 μg +無血清培養基 500 μl），同時配置轉染試劑-培養基混合物（轉染試劑 25 μl +無血清培養基 500 μl），上述混合物分別靜置 5 min 后進行混合，靜置 20 min 后加入上述細胞內，37 ℃，5% CO2培養 6 h，將培養基換成 6 ml 5% 胎牛血清 DMEM/F12 培養基繼續培養，并運用 Zeocin 和有限稀釋法進行單克隆篩選。

1.2.4 外源 SM 蛋白表達的鑒定 收集培養 72 h的轉染 SM 基因的 CHO-AV 細胞，細胞計數，用 PBS 洗滌 3 次，參照動物細胞總 DNA、RNA、蛋白分離試劑盒的說明分別提取基因組 DNA、總 RNA 和總蛋白，用于 SM 基因的 DNA 水平、mRNA 水平及蛋白水平的檢測。在進行基因組 DNA 水平檢測時，以基因組 DNA 作為模板，以引物12以及引物18c118c2 進行 PCR 擴增，產物進行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。在進行 mRNA 水平檢測時，參照 TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒，以上步驟中獲得總 RNA 為模板，以 Oligo(dT) 為引物逆轉錄合成 cDNA；以 cDNA 作為模板，以引物1、2及引物18c1、18c2 進行 PCR 擴增，擴增產物進行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。在進行蛋白水平檢測時，以 CHO-K1 細胞總蛋白為陰性對照，并將提取的總蛋白進行 SDS-PAGE 電泳及 Western blot 鑒定。一抗為鼠抗人sly1 抗體和羊抗人munc18c抗體，二抗為 HRP 兔抗鼠多抗和 HRP 驢抗羊多抗。

1.2.5 ELISA 篩選高表達細胞株 運用雙抗體夾心 ELISA 測定上清抗體濃度，包被抗體為羊抗人 IgG Fc 抗體，標準品為人 IgG，酶標二抗為羊抗人 κ 鏈抗體。從中挑選出抗體表達量最高的一株細胞命名為 CHO-AV-SM，進行懸浮適應。

1.2.6 懸浮培養 CHO-AV-SM 細胞與 CHO-AV 細胞表達、生長曲線的測定和比較 CHO-AV-SM 以及 CHO-AV 以 3 × 105個/ml初始細胞密度接種于 30 ml 無血清培養基，37 ℃、5% CO2、110 r/min 培養。每 24 小時取一次樣（約 500 μl），臺盼藍染色計活細胞數及總細胞數，同時離心凍存上清。當細胞活力低于 50% 時，終止細胞培養。ELISA 檢測各時間點樣品抗體濃度。計算抗體比產率，繪制活細胞數-時間、細胞存活率-時間、抗體濃度-時間、抗體比產率-時間曲線圖。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 SM 基因的克隆

從 HEK293FT 中提取總 RNA 的電泳結果如圖 1 所示。圖中 RNA 可見 28s 和 18s 兩條帶且 28s 帶亮度超過 18s，說明所提 RNA 基本未降解；紫外分光光度法檢測總 RNA 濃度為 601 ng/ml。使用1 基因引物和18c基因引物分別進行 RT-PCR 后，電泳結果如圖 2 所示，1 片段電泳條帶在約 1930 bp，18c片段電泳條帶約在 1780 bp，大小符合預期。

bp M RNA 2000 15001000 28s 18s

Figure 1 Total RNA of HEK293FT cells

2.2 共表達載體鑒定

pBudCE4.1-1、pBudCE4.1-18c 和 pBudCE4.1-1-18c 質粒示意圖如圖 3所示。對構建的共表達載體 pBudCE4.1-1、pBudCE4.1-18c和pBudCE4.1-1-18c 進行 PCR 鑒定，結果如圖 4 所示。1 片段和18c片段的電泳條帶分別約 1930 bp 和 1780 bp，大小符合預期。pBS 大提質粒濃度為504 ng/μl，回收體積 1.5 ml；pBM 大提質粒濃度為 560 ng/μl，回收體積 1.5 ml；pBSM 大提質粒濃度為 613 ng/μl，回收體積 1.5 ml。

bp M sly1 munc18c 20001500

Figure 2 To clone1 and18c gene by RT-PCR from total RNA of HEK293 cells

2.3 SM 基因共表達載體轉染 CHO-AV 細胞株

2.3.1 Zeocin 篩選細胞狀態觀察及有限稀釋法挑單克隆 24 h 后按照 1:10 消化傳代，48 h 后加 Zeocin 培養。每 3 天換一次培養基，維持 Zeocin 濃度在 200 μg/ml，加壓篩選 12 d。從加 Zeocin 開始 4 ~ 5 d 內，細胞狀態正常；5 d 后細胞開始大量死亡，具體表現為細胞變大膨脹，有些細胞形狀由梭形變成不規則形，部分細胞有明顯空泡形成，有死細胞漂浮在培養基中（圖 5A）。10 d后具有抗性的單個細胞克隆形成（圖 5B）。至 12 d 將所有細胞克隆消化，有限稀釋法挑單克隆。鋪板 6 ~ 7 d 后在鏡下可看到明顯的單克隆形成（圖 5C）。

圖 3 質粒結構示意圖（1：pBudCE4.1-sly1；2：pBudCE4.1-munc18c；3：pBudCE4.1-sly1-munc18c）

Figure 3 Schematic diagrams of plasmid (1: pBudCE4.1-1; 2: pBudCE4.1-18c; 3: pBudCE4.1-1-18c)

bp M1 1 2 3 4 M2bp 20001500 20001500

Figure 4 Determination of1 and18c PCR fragments of plasmid pBudCE4.1-1, pBudCE4.1-18c and pBudCE4.1-1-18c

2.3.2 SM 基因表達的鑒定

2.3.2.1 基因組水平及轉錄水平鑒定 收集培養 72 h 的細胞抽提基因組 DNA、總 RNA 和總蛋白，將總 RNA 反轉錄為 cDNA，以 gDNA 和 cDNA 為模板，分別用1 基因引物1、2 以及18c基因引物18c1、18c2 進行 PCR 擴增，結果如圖 6 ~ 7。1 片段電泳條帶約在 1930 bp，18c片段電泳條帶約在 1780 bp，大小符合預期。

2.3.2.2 蛋白水平鑒定 CHO-AV 總蛋白為陰性對照，上樣量均為 20 μl，進行 SDS-PAGE 電泳，使用抗人sly1 抗體和抗人 munc18c 抗體進行Western blot 檢測，結果如圖 8 所示。sly1蛋白理論分子量為72.3 kD，munc18c理論分子量為 67.7 kD。結果顯示 5 株穩定轉染細胞均有人源sly1 和 munc18c 蛋白的表達，CHO-AV 細胞自身表達的sly1 和 munc18c是非人源蛋白，理論上檢測不到，在sly1 和munc18c蛋白分子量理論值附近沒有條帶。

圖 5 鏡下觀察 Zeocin 篩選細胞狀態及單克隆細胞形成（A：細胞因 Zeocin 篩選大量死亡；B：抗性細胞克隆形成；C：單克隆示意圖）

Figure 5 Cellular morphology and single clones during Zeocin screening under microscope detection (A: Large number of cells died during Zeocin screening; B: Zeocin resistant cell colony appeared; C: Microscope detection of single colony)

bp M1 g1 g2 g3 g4 g5 g6 M2 c1 c2 c3 c4 c5 c6 M3bp 20001500 20001500

Figure 6 Fragments of1 from gDNA and cDNA of stable expression cells

bp M1 g1 g2 g3 g4 g5 g6 M2 c1 c2 c3 c4 c5 c6 M3bp 20001500 20001500

Figure 7 Fragments of18c from gDNA and cDNA of stable expression cells

kD M 1G11 2F7 3D5 4D10 4C5 CHO-AV 75 60

Figure 8 Western blot of sly1 and munc18c from different clones

2.4 ELISA 篩選高表達單克隆細胞株

從有限稀釋的 4 塊 96 孔板中挑選形態較好的 5 株單克隆擴大培養，編號為（96 孔板編號 + 各孔編號）1G11、2F7、3D5、4D10、4C5 并凍存。6 孔板到 T-25 瓶擴大過程中收取上清，以 CHO-AV 表達上清為陰性對照進行檢測。結果如表 1。將表達量最高的細胞株 CHO-4C5命名為 CHO-AV-SM，接入搖瓶懸浮適應培養。

2.5 懸浮培養 CHO-AV-SM 細胞與 CHO-AV 細胞表達、生長曲線的測定和比較

CHO-AV-SM 和 CHO-AV 以 3 × 105個/ml 初始細胞密度接種于 30 ml CD-CHO 培養基，每 24 小時取樣，以臺盼藍染色計活細胞數及總細胞數，同時離心凍存上清。12 d 后終止細胞培養。ELISA 檢測各時間點樣品抗體濃度。計算抗體比產率，公式如下：

公式中 qMab：抗體比產率；TH：抗體最終濃度（μg）；TI：抗體初始濃度（μg）；VH：最終細胞數（106cells）；VI：接種細胞數（106cells）；t：時間（d）。

繪制活細胞數-時間、細胞存活率-時間、抗體濃度-時間、抗體比產率-時間曲線圖。如圖 9 所示，CHO-AV 細胞在批培養條件下前 6 天細胞活力維持在約 100%，且第 6 天細胞數達到最大值，之后下降，到第 12 天細胞活力已低于 50%；抗體濃度一直在增加，但抗體比產率呈現逐漸下降趨勢。與參考文獻結果相比，CHO-AV 生長速率及最大密度有較大差距。

所謂“陽光是最好的防腐劑”⑩，透明度在規則制定中一直占有重要地位。透明度在公開和保密之間形成張力:政府機構或企業為追求透明度而公開信息，可能會損害國家安全或商業秘密等重要利益，不充分的透明度則會導致信任缺失，而無意的披露又可能造成損害隱私或泄露機密等不利后果。有研究提出大數據的“透明悖論”?，即某些機構為了執行任務或提供服務，會運用法律和商業秘密武器來隱匿其數據收集行為及收集的數據，因而如何發現數據收集行為并要求其實現透明度呢?

同 CHO-AV 細胞相比，CHO-AV-SM 細胞參數變化趨勢基本一致，如圖 9 所示，前 6 天細胞活力維持在約 100%，第 6 天細胞數達到最大值，之后下降，到第 12 天細胞活力已低于 50%；抗體濃度一直增加，但抗體比產率呈現逐漸下降趨勢。這提示插入新的外源基因會影響細胞的生長，但驗證了在宿主細胞過表達sly1和munc18c的促分泌表達作用。這兩株細胞的細胞密度均在培養第 6 天達到最大值，此后細胞大量死亡。由于死細胞裂解物給培養上清帶來許多雜蛋白，影響產物質量。因此我們以第 6 天抗體濃度進行比較：此時 CHO-AV 細胞的抗體表達量約為 45.4 μg/ml；CHO-AV-SM 細胞的抗體表達量為 79.5 μg/ml，在 CHO-AV 基礎上提高約 75%，這與貼壁培養數據接近。

表 1 部分高表達細胞株抗體表達量

圖 9 懸浮培養的 CHO-AV-SM 與 CHO-AV 細胞的活細胞數-時間（A）、細胞存活率-時間（B）、抗體濃度-時間（C）、抗體比產率-時間（D）曲線對比

Figure 9 The comparison of viable cell density (A)、cell viability (B)、antibody titer (C) and Qp (D) between CHO-AV-SM and CHO-AV

將 CHO-AV-SM 細胞數據和 CHO-AV 細胞數據對比，可以看出 CHO-AV 細胞的生長速率及最大密度略高于 CHO-AV-SM 細胞，但是 CHO-AV 細胞的抗體產量和抗體比產率低于 CHO-AV-SM 細胞。

3 討論

分泌表達是真核細胞表達基因工程重組蛋白的主要表達途徑。經研究表明有多種因素影響抗體基因在 CHO 細胞中穩定表達，包括抗體基因在宿主染色體上的整合位點、基因拷貝數、抗體mRNA的轉錄效率和 mRNA 的穩定性、抗體基因的翻譯、抗體輕重鏈的組裝、分泌以及抗體本身結構等多個方面。在外源基因拷貝數及其轉錄水平達到蛋白轉運能力的上限時，提高細胞分泌能力有助于重組蛋白表達量的提升。囊泡的轉運和分泌實質上是胞內膜分離和融合的循環過程。研究發現，所有囊泡轉運途徑中的胞內膜融合過程都需要 SNARE 蛋白家族和SM蛋白家族協同參與調節。其中 SM 蛋白是一類親水性蛋白質，由 600 個左右氨基酸組成，其空間結構大致為“弓形”結構蛋白[4]。利用 SM 蛋白促進細胞分泌的特性，近年來人們開始嘗試以介導胞內大分子運輸的轉運蛋白為靶點提高重組蛋白表達量并取得了突破。Peng和Fussenegger[5]的研究表明，在 CHO 細胞中過表達sly1可以使利妥昔單抗的表達量提高 10 倍，同時表達Sly1和Munc18c則可以使其產量提高 15 倍。Hou 等[6]構建了穩定表達 SLY1 和 SEC1 的釀酒酵母并分別用來表達異源蛋白（人胰島素前體、曲霉α-淀粉酶）和內源蛋白（轉化酵素），結果各個目的蛋白表達量均有不同程度的提升。由于 CHO 細胞與人細胞的 SM 基因具有較高同源性，推測其 SM 基因調控囊泡轉運機制與人細胞類似，所以本課題選擇從人細胞中克隆 SM 基因并進行后續研究。

本研究將含有1 和18c基因的真核共表達載體導入 CHO-AV 細胞株，在研究中首先從人細胞克隆了1 基因和18c基因并構建表達載體 pBS、pBM 和 pBSM。通過 SM 基因的穩定轉染，我們獲得的基于 SM 基因的分泌工程化改造的 CHO 細胞株 CHO-AV-SM 與原細胞株 CHO-AV 抗體表達量相比提高約 75%，但與參考文獻中 SM 促表達效果相比還有差距。這可能是因為篩選得到的 CHO-AV 細胞表達量處于較低水平，轉運途徑的瓶頸效應對其影響較小，因此，SM 基因無法表現出較好的促表達效果。在后續工作中應該對載體元件和篩選方法進行系統優化，與分泌途徑優化一起協同提高 CHO 工程細胞株的抗體表達量[7]。從圖 9可以看出，CHO-AV 細胞及 CHO-AV-SM 細胞在批懸浮批培養條件下前 6 天細胞活力維持在近 100%，且第 6 天細胞數達到最大值，之后下降，到第 13 天細胞活力已低于 50%；抗體濃度持續增加，但比產率呈現逐漸下降趨勢。與參考文獻結果相比，各個參數的變化趨勢大致相同，但生長速率及最大密度低于參考文獻結果。CHO-AV 細胞和 CHO-AV-SM 細胞相比，CHO-AV 細胞的生長速率及最大密度略高于 CHO-AV-SM細胞。一種可能是因為穩定轉染后，外源基因隨機插入基因組，有可能破壞宿主細胞正常功能的序列，造成不同細胞單克隆之間生長特性的差異；另一種可能則是外源蛋白的表達增加了宿主細胞的代謝負擔，更多的營養物質被用來表達而非生長。所以在篩選過程中不但要考察細胞的表達量，還應該考察細胞的生長情況，選擇表達量高且生長情況良好的細胞株進行后續開發[8]。另外也可采用定點整合技術，將外源基因定向插入 CHO 細胞基因組的高表達位點，從而提高篩選成功率[9]。

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High expression of antibody in secretion engineered CHO cells based on SM protein

LIU Yi-hua, TONG Mei, LIU Jin-yi, XU Chen

The aim of this study is to investigate the improvement of secreted protein expression by constructing antibody-producing CHO cells based on molecular engineering of secretion, which includes SM gene over-expression and cell adaptation to suspension culture.

In this study, we first cloned1 gene and18c gene from human cells and constructed the eukaryotic co-expression vector. We then successfully transfected the1 and18c genes into CHO-AV cells, and identified the SM protein expressing CHO-AV-SM cells. We next suspended the adapted CHO-AV-SM cells in culture and determined the growth and the expression parameters of CHO-AV and CHO-AV-SM cells.

Due to SM transporter protein gene over-expression, antibody expression of CHO-AV-SM cell line was increased by 75%,as compared with CHO-AV cells. On the sixth day the cell number reached the maximum, and the antibody production of CHO-AV and CHO-AV-SM cells was about 45.4 μg/ml and 79.5 μg/ml, respectively.

This study improves the antibody production of CHO cells by molecular engineering of secretion, which includes SM gene over-expression and cell adaptation to suspension culture. This provides supports to molecular engineering of CHO-cell secretion and antibody production improvement.

CHO cells; Protein engineering; SLY1 proteins; MUNC18C proteins; Bevacizumab

XU Chen, Email: xuchen@triprime.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.003

徐晨，Email：xuchen@triprime.com

2014-05-16

AuthorAffiliations: College of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China (LIU Yi-Hua); Beijing Tri-Prime Genetic Engineering Co., Ltd, Beijing 100260, China (TONG Mei, LIU Jin-yi, XU Chen)