重組人血小板源生長因子的藥學研究進展

范寶慶，薛雯，于聰，曹小丹，黃瑞晶，李靜，徐立華，張學況，張玲，李劍

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重組人血小板源生長因子的藥學研究進展

范寶慶，薛雯，于聰，曹小丹，黃瑞晶，李靜，徐立華，張學況，張玲，李劍

300452 天津，天士力控股集團研究院生物藥品研究所

血小板源生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一種通常存貯于血小板 α 顆粒中的堿性蛋白質，由血小板趨化到受損部位的巨噬細胞，受損血管處的平滑肌細胞以及受損部位的血管內皮細胞等多種細胞所分泌。自從發現 PDGF 后，人們已成功地純化了人、豬、牛、羊等的 PDGF，并對其理化性質進行了大量的研究。PDGF 是一種熱穩定的陽離子型糖蛋白，分子量為 28 ~ 35 kD，是由分子量分別為 13 ~ 14 kD 和 16 ~ 17 kD 的兩個亞基通過二硫鍵連接組成。PDGF 的等電點為 9.8 ~ 10.2，具有耐高溫（100 ℃）、耐酸（pH 2.5）以及耐受各種解離劑（4 mol/L 鹽酸胍、6 mol/L 尿素、2% SDS）的特點。凝膠層析發現，人 PDGF 在體內有兩種形式，即 PDGF-I（分子量為 31 kD）和 PDGF-II（分子量為 28 kD），兩者在氨基酸及以共價鍵相連的碳水化合物的組成上有所不同，但其致絲裂活性相似[1]。

PDGF 是由 A、B 兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同型或異型二聚體，包括三種形式：PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB。在人類血小板來源中 85% ~ 90% 的 PDGF 為 AB 型，10% ~ 15% 為 BB 型，A、B 鏈基因分別位于第 7、22 號染色體，經 2-巰基乙醇還原或胰蛋白酶消化后，分解為兩條無活性的亞基，其生物學活性也幾乎完全消失，由此證明連接兩個亞基的二硫鍵對保持PDGF 的生物學活性起著十分重要的作用，其空間結構如圖 1 所示。

PDGF 的主要生物學特性有：①趨化作用：刺激成纖維細胞、平滑肌細胞、中性粒細胞、單核細胞的趨化遷移，對機體的損傷修復極為重要；②致分裂性：促進多種細胞的 DNA 合成和細胞裂解、增殖；③增加細胞外基質（ECM）的合成積聚：促進多種 ECM 成分如膠原纖維、整合素、纖維連接蛋白（FN）、層黏蛋白（LN）、黏多糖等的合成，抑制 ECM 的降解，參與組織器官纖維化、硬化的發生、發展過程；④血管活性效應：能誘導不同類型血管的收縮[2]。

1 PDGF 的生產工藝研究進展

繼PDGF-A 鏈和PDGF-B 鏈的氨基酸序列被報道后，關于PDGF 的研究工作迅速開展起來。20 世紀 80 年代初期美國就開始對 PDGF 展開研究，到 80 年代末 90 年代初取得了實質性進展，并申請了大量專利，形成了 PDGF 的核心技術。其中 Chiron 公司研究獲得突破，通過重組 DNA 技術，制備了 PDGF-AA，并申請了專利。此外，其他許多公司對該項目也投入了大量研究，其中有關于 PDGF-BB、PDGF-AB 的制備技術和PDGF 藥物的作用等研究工作[3]。據統計，美國有關 PDGF 的專利有 46個，主要針對其載體及表達菌株的構建、相關疾病的治療研究等方面，其中 12 個專利具有很大的研究和借鑒價值。FDA 于 1997 年 12 月 16 日批準了 Ortho-McNeil Pharmaceuticals 和 Johnson & Johnson 公司用于治療糖尿病神經病理性下肢潰瘍的貝卡普勒明凝膠（Becaplermin）（商品名Regranex）的生產[4]。

圖 1 PDGF-BB 的蛋白結構

國內多家單位也進行了大量相關的基礎性研究，李發武等根據 PDGF-B 鏈序列設計合成含靶向PDGF 基因 siRNA 轉錄模板的莖環結構，與兩端分別有H I、III酶切位點的 pSilencer3.1-Hlhygro 質粒連接，轉化大腸桿菌，擴增、純化得到所需質粒。通過瓊脂糖凝膠電泳及基因測序鑒定其分子量及插入片段的序列。結果表明，PCR 擴增片段與預期結果相符，雙酶切證實 PDGF siRNA 表達載體克隆構建成功[5-6]。楊春露等[7]利用RT-PCR從人血管內皮細胞總RNA 中擴增出PDGF-B 的 cDNA，然后克隆至酵母表達質粒 pMETB 和 pMETαA，從而獲得了含信號肽（578 bp）和不含信號肽（340 bp）的編碼 PDGF-B 鏈基因，構建了 PDGF-B 的酵母表達載體 pMETB-PDGFB1、pMETαA-PDGFB2。陳建庭等[8]用基因重組技術構建 pQE-PDGF-B 原核表達載體，在 M15 大腸桿菌中進行 PDGF-B 單體蛋白的表達。結果經酶切鑒定、PCR 鑒定及基因測序證明，pQE30 載體上成功地插入了PDGF-B 成熟肽基因。薛亮等[9]建立了重組人血小板源生長因子-BB（rhPDGF-BB）在釀酒酵母中的表達及純化工藝。在 5 L 發酵罐中，探討接種量、溶氧、誘導溫度和誘導 pH 值對菌體密度及目的蛋白表達量的影響，并通過離子交換層析和凝膠過濾層析對目的蛋白進行純化。經 84 h 發酵，細胞600值可達 65.1，目的蛋白表達量占 26%。純化后的蛋白純度可達 95%，產量為 15.4 mg/L，收率為 21.9%，為其大規模生產奠定了基礎。董榮娜等[10]通過脂質體瞬間轉染的方法將含有rhPDGF-BB 全長的質粒轉染CHO 細胞系，穩定表達 rhPDGF-BB 的 CHO 細胞具有新的生物學功能，實現了組織工程種子細胞的構建，為研究糖尿病潰瘍創面愈合的生物材料提供實驗基礎。任雨笙等[11]采用超聲裂解、酸醇抽提、離子交換色譜、凝膠色譜等方法提純 PDGF，用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其相對分子質量，并檢測其生物學活性，建立簡單有效的豬PDGF 純化方法，純化的 PDGF相對分子質量為（2.879 ~ 3.078）× 104，活性回收率為 3%，比活性為 3.41176 × 105U/mg，為進一步研究PDGF 的理化性質及生物學特性打下基礎。高凱等[12]建立了重組人血小板源生長因子（rhPDGF-BB）的質控方法和質量標準，具有保證產品安全、有效、質量可控的特點，可用于重組人血小板源生長因子產品的常規檢定。

北京金賽獅生物制藥技術開發有限責任公司成功建立了生產rhPDGF-BB的方法，將 PDGF-B 基因正確置于酵母表達載體 pPICZ-αA，轉化酵母菌株 SMD1168H，經篩選建立分泌表達 rhPDGF-BB 的工程菌株，經過兩級種子培養，上罐發酵，純化，從而獲得了rhPDGF-BB 重組蛋白。天士力控股集團研究院從北京金賽獅生物制藥技術有限公司引進 rhPDGF-BB 項目，并進一步推進其藥學研究，包括發酵工藝優化放大研究，最佳培養基配方篩選、優化 pH、溫度、發酵時間、氧載體等發酵工藝參數，確定最佳發酵工藝路線，使表達量達到 40 mg/L，為大規模發酵奠定基礎；同時進行了純化工藝的優化放大研究，利用正交實驗和析因實驗研究最佳上樣量、流速、pH 和電導等參數，確定最佳的工藝路線，使收率和產量比轉讓工藝有大幅度提高，為大規模純化奠定基礎；制劑工藝學研究，采用先進的生物活性凝膠制劑作為藥物劑型，深入研究如何大規模制備穩定的 rhPDGF-BB 水凝膠制劑，在此基礎上已經成功進行了臨床I、II 以及 III 期用藥的生產工作。

2 PDGF 的制劑制備研究進展

卓冰[13]報道了新的重組血小板源生長因子的水凝膠制劑制備方法。該水凝膠制劑含有：藥物成分rhPDGF-BB、水凝膠基質、穩定劑、等滲劑和 pH 調節劑。其中水凝膠基質主要外用于治療糖尿病患者的潰瘍傷口，特點在于：在濕潤的環境下，有利于傷口的愈合；基質本身具有彈性和柔軟性，同時外觀透明；透過凝膠持續緩慢釋放藥物，維持藥效作用時間。經過試驗和篩選，選擇了新型輔料卡波姆。卡波姆是一種聚丙烯酸交聯樹脂，在很低的濃度下即可形成較高黏度的凝膠[14-16]。可用于制備水凝膠的卡波姆型號較多，主要有兩類。其中Carbomer 1940 分子鏈較短、黏度高、吸附能力強，藥物釋放緩慢。用其作為基質時藥物釋放緩慢、持久。經試驗表明，當其濃度為 0.4% 時具有很好的穩定性和藥效。而 Carbomer 1981 類分子鏈長、黏度低。當它作為 PDGF 藥物基質時，該凝膠皮膚吸附力強，較快發揮藥效。另外，選擇氨基酸作為穩定劑，0.9% 氯化鈉、5% 葡萄糖和 3% 甘露醇作為等滲劑，10% NaOH 作為 pH 調節劑，在藥劑學中常用的防腐劑中優選 0.8% 的尼泊金乙酯，另加入金屬絡合劑 0.3% 的 EDTA-Na 起到穩定作用。FDA 批準的 rhPDGF-BB 在中國知識產權局申請的專利 96198773.1 中，其權利要求保護的是 PDGF 的凝膠制劑，該凝膠制劑凝膠基質為纖維素聚合物，及可藥用的帶電荷化學物質，包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、魚精蛋白、丙氨酸等與鋅、鎂的組合[17-18]。

3 PDGF 的藥理毒理學研究進展

戴禮蘋等[19]以鏈脲霉素（streptozocin，STZ）所致糖尿病小鼠（STZ 小鼠）以及非肥胖型糖尿病（non-obese diabetes，Nod）小鼠（Nod 小鼠）為模型，制作全厚度皮膚切口，用 rhPDGF 對其連續治療 5 d，觀察皮膚創口愈合情況，結果 rhPDGF 能明顯促進糖尿病小鼠皮膚創口的愈合，10 μg/cm2即有明顯促進糖尿病小鼠皮膚創口愈合的作用。孫同柱等[20]將 26 只糖尿病大鼠在背部兩側各制備 2 個全層皮膚缺損創面，隨機分成五組進行實驗，結果顯示 rhPDGF-BB 對糖尿病大鼠全層皮膚缺損創面有明顯促修復作用，表現在促進創面肉芽組織生長、毛細血管胚芽形成與再上皮化。rhPDGF-BB 的三種不同劑量中，以中劑量（7.0 μg/cm2）組表現出促創面修復作用最為明顯。鐘建莉等[21]探討了 rhPDGF-BB 對大鼠正畸牙移動過程中破骨細胞 FAK 表達的影響，發現 rhPDGF-BB 作為局部調節因子促進了正畸牙移動骨改建過程。在大鼠正畸牙壓力側牙槽骨改建的過程中，FAK 參與了整合素 α_vβ_3 在破骨細胞信號轉導的下游通路，其表達能被外源性的 rhPDGF-BB 所調節。陳強等[22]以切除小白鼠背部皮膚制作創傷模型，人造皮膚覆蓋傷口，并在人造皮膚下注射牛PDGF 2 pg/d，共注射 3 d，于注射完畢后第 3、7、10 天對傷口新生上皮肉芽組織生長情況進行觀察，結果表明，牛 PDGF 能促進肉芽組織生長上皮再生，使傷口加速愈合，提示牛 PDGF 可應用于臨床創傷治療[22-25]。

4 PDGF 的臨床藥物的進展

Becaplermin 是目前唯一一個被 FDA 批準治療糖尿病足潰瘍的生長因子藥物[26-30]。除此之外，Chiron 和Johnson & Johnson 研制的 rhPDGF-BB 針對壓迫性潰瘍和靜脈性潰瘍已經進入臨床 III 期試驗。國內多家科研單位也進行了該項工藝的研發，但是沒有獲得實質性的突破，且研究大多處于基礎研究階段。天士力控股集團研究院自接手rhPDGF-BB 項目后，繼續推進 PDGF-BB 藥學及其臨床研究，現已成功完成此項目的基礎研究，并采用嚴格的隨機盲法對照方案，對試驗藥品的有效性和安全性作出初步評價，在此基礎上完成了 I、II 期臨床研究，并已經啟動了 III 期臨床試驗。在I 期臨床中，考察了單劑量和多劑量外用 rhPDGF-BB 凝膠劑在中國健康受試者中的耐受性特征，制劑規格為 5 g，每克含 rhPDGF-BB 0.1 mg 或 10 000 單位，中國健康受試者單劑量外用 0.25 ~ 4 g 和多劑量外用 0.5 ~ 2 g 的 rhPDGF-BB 凝膠劑是安全的，能夠很好耐受，為該藥臨床應用的安全、合理使用提供依據。II 期臨床采用隨機、雙盲、多中心、安慰劑平行對照評價 rhPDGF-BB 不同劑量治療慢性糖尿病足潰瘍 II 期的臨床效果。其安全性良好，不良反應輕微，治療 20 周內高劑量組（100 μg/g）目標潰瘍完全愈合率優于低劑量組（30 μg/g）和對照組，推薦采用高劑量組（100 μg/g）進行 III 期臨床試驗，進一步確認其治療慢性糖尿病皮膚潰瘍的有效性和安全性[31-32]。目前 III 期臨床試驗正在進行中。

rhPDGF-BB 經過十多年時間的市場應用，其安全性和有效性在臨床上得到了充分證明；rhPDGF-BB 尤其對病理性深度潰瘍的傷口增殖修復、促進皮膚血管的再生有明顯療效。國際市場上銷售的 Becaplermin（含 0.01% rhPDGF-BB），每支售價為 275 英鎊/15 g，天士力預計售價為 150 元人民幣，價格優勢明顯，競爭力強。此外，rhPDGF-BB 目前大量用于高檔生物化妝品和大規模細胞培養，因此也可以出口 rhPDGF-BB 原料藥，擴大產品市場。天士力開發的制劑產品具有顯著的成本優勢，具備同國際上同類產品競爭的實力，可以拓展國際市場，出口創匯，創造更大的經濟和社會效益。

5 結語

隨著對 PDGF 基礎研究的深入，rhPDGF 表達的各種不同的工程菌被構建，發酵和純化等路線的進一步優化，PDGF 的產業化會很快實現，對于它的藥理與毒理學的認識也會進一步加深，rhPDGF-BB 作為臨床用藥，在治療一些慢性難愈合性傷口如糖尿病潰瘍、慢性靜脈性潰瘍、褥瘡、放射性潰瘍等方面已經取得了非常不錯的療效，并且將被進一步用于佐劑、蛋白載體、生物材料等多個方面，估計在不久的將來，rhPDGF 會在醫學、生物學等各方面發揮更重要的作用。

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天津市科技支撐計劃重點項目（09CKFSH00200）；“十二五”國家科技重大專項（2011ZX09202-301-06）

李劍，Email：lijian16@tasly.com.cn

2013-11-07

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.009