高效液相色譜法測定斑蝥素鈉維生素B6注射液中維生素B6的含量

江蘇省泰州市食品藥品檢驗所 （225300） 顧秋琴

斑蝥酸鈉維生素B6注射液（Disodium Cantharidinate and Vitamin B6Injection）為復方制劑，其組分為：斑蝥酸鈉和維生素B6，適用于原發性肝癌、肺癌及白細胞低下癥。維生素B6參與氨基酸和脂肪的代謝，刺激白細胞生成。該制劑中維生素B6的含量測定現行國家藥品標準WS-10001-(HD-0046)-2002采用吸收系數法，方法易受影響因素干擾，專屬性不高。本文建立了操作簡便，專屬性更強的HPLC法測定維生素B6的含量，結果準確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Waters 2695型高效液相色譜儀（檢測器：Waters2996二極管陣列），waters symmetry C18色譜柱（150mm×4.6mm,5μm）；日本島津UV-2550型紫外分光光度計。

1.2 試藥 斑蝥酸鈉維生素B6注射液（貴州某制藥股份有限公司，規格：10ml，批號：2012090901，2012100403，2013040201）；斑蝥酸鈉（廠家提供）；戊烷磺酸鈉、冰醋酸均為分析純，水為超純水，甲醇為色譜純。

1.3 對照品 維生素B6對照品（中檢院，批號10116-201103，含量：100.0%）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品維生素B650mg，置50ml容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；精密量取對照品儲備液5ml，置100ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取供試品10ml（約相當于維生素B62.5mg），置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 空白溶液的制備 按處方比例，取斑蝥酸鈉適量加注射用水制成空白供試品，再精密量取空白供試品10ml，置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

附圖 高效液相色譜圖

附表 1 回收率試驗結果（n＝6）

附表 2 樣品含量測定結果（標示量/%）

2.2 色譜條件與專屬性考察 以0.04%戊烷磺酸鈉（用冰醋酸調節pH值至3.0）-甲醇（88∶12）為流動相，檢測波長為291nm；流速約為1.0mL·min-1；柱溫為35℃；進樣量10μL。分別取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液進樣，記錄色譜圖。結果空白溶液無干擾，理論板數按維生素B6計算約為4500，見附圖。

2.3 標準曲線與線性范圍 分別精密量取維生素B6對照品儲備液1ml、2ml、3ml、4 ml、5ml置25ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。照“2.2”項下色譜條件分別進樣，結果在39.33～196.6 mg·L-1范圍內，回歸方程A=23169C+8178（r＝1.000），色譜峰面積與濃度呈良好線性關系。

2.4 精密度與重復性實驗 取濃度為49.16mg·L-1的對照品溶液重復進樣5次，測得峰面積的RSD為0.25%(n＝5),表明本方法的精密度良好；取供試品（批號：2012090901），平行制備5份供試品溶液，分別測定維生素B6的含量，平均為99.74%， RSD為0.21%（n＝5），表明本方法重復性良好。

2.5 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于0、6、12、18、24h進樣，記錄維生素B6的峰面積， 計算RSD為0.32%，表明維生素B6在24h內穩定。

2.6 檢測限和定量限 取對照品溶液，經過一系列稀釋，進樣測定，以基線噪音的3倍計算，維生素B6的最低檢測濃度為0.079 mg·L-1；以基線噪音的10倍計算，維生素B6的最低定量濃度為0.296 mg·L-1。

2.7 回收率試驗 分別精密量取9份已測知含量的供試品（批號：2012090901）10ml置50ml容量瓶中，再分別精密加入對照品儲備液2 ml、2 ml、2 ml、2.5 ml、2.5 ml、2.5 ml、3ml、3 ml、3ml，加流動相稀釋至刻度，按樣品含量測定項下方法測定，計算回收率，結果見附表1。

2.8 樣品含量測定 取對照品溶液與供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，按外標法計算含量，并與紫外-可見分光光度法測定結果作比較（附表2）。

3 討論

參照《中國藥典》2010年版二部正文維生素B6原料的含量測定，適當調整有機相和水相的比例，采用0.04%戊烷磺酸鈉 （用冰醋酸調節pH值至3.0）-甲醇（88∶12）為流動相，斑蝥酸鈉維生素B6注射液樣品的出峰時間適宜，峰形好，理論板數高。

采用二極管陣列檢測器分別對供試品溶液和對照品溶液在200～350nm波長范圍內進行3D圖譜掃描，結果均在291nm有最大吸收，故選擇測定波長為291nm。

由附表2可見，兩種方法測定三批樣品的結果基本一致，但吸收系數法因方法本身的專屬性不高，易受測定環境、儀器性能及樣品中含有在291nm波長處有紫外吸收的其他物質的干擾。而高效液相法的專屬性強，更適用于測定斑蝥酸鈉維生素B6注射液中維生素B6的含量。