動脈粥樣硬化性腦梗死患者血漿抗凝血酶Ⅲ的變化及其機制*

林旭紅， 魏丹丹， 王慧超， 徐 靜， 王見濤，白春洋， 王亞強， 趙耀亭， 李倩一， 任學群

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)，是指急性起病迅速出現的腦組織因缺血、缺氧而發生的局限性或彌漫性腦功能缺損征象的血管性事件，其導致的死亡率居全球第三［1］。腦梗死的主要病理是由于供應腦部血液的動脈出現粥樣硬化和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，導致局灶性急性腦供血不足而發病。腦卒中以其高發病率、高病死率、高致殘率而構成對人類健康的巨大威脅，因此探討其發病機制對防治腦血管病具有重大社會意義。本研究通過檢測55例腦梗死患者血漿抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)水平，探討其與腦動脈血栓形成的關系，以及AT-Ⅲ在腦動脈血栓形成中變化的機制，為腦卒中的防治提供有意義的理論基礎。

材料和方法

1 研究對象與分組

病例來自2012年11月～2013年4月河南大學淮河醫院神經內科住院患者。實驗組55例，其中男35例，女20例，年齡30～82歲，平均年齡(64.2±11.3)歲。符合1995年第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準，經頭部CT或MRI證實，并且經TCD(經顱彩色多普勒超聲)及頸部CDFI(頸部彩色多普勒超聲)證實除外血管狹窄及硬化;同時符合美國國立衛生研究院卒中量表積分(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)＞2，從癥狀發生到血標本收集時間間隔≤48 h。患者生理功能及神經損傷程度根據NIHSS［2］評估，分值越大，卒中程度越重。另選我院同期健康體檢者55例為正常對照組，其中男30例，女25例，年齡28～77歲，平均年齡(62.3±5.8)歲，與實驗組相匹配，見表1。所有病例均除外3個月內手術史、外傷、急慢性肝病、血液系統疾病、腎病綜合征、急慢性炎癥疾病及口服避孕藥等情況。

2 方法

2.1 標本采集和制備 受試者于入院次日晨空腹抽靜脈血，部分全血用于分離、鑒定、培養單核細胞，取3.6 mL加入0.109 mmol/L枸櫞酸鈉0.4 mL抗凝

表1 試驗組與對照組一般情況比較Table 1.Comparison of the general clinical data(Mean±SD.n=55)

試管中，3 000 r/min離心10 min，上層血漿測定AT-Ⅲ活性;另取肝素抗凝血血漿，分成3份備用，分別測定免疫復合物、常規生化項目及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素 6(interleukin 6，IL-6)水平;EDTA抗凝血分離單核細胞，進行流式細胞術檢測。對照組空腹采集肘靜脈血，標本處理與試驗組相同。

2.2 發色動物法測定AT-Ⅲ活性 應用STAGO-R Evolution全自動血凝儀以發色動物法直接上機測定血漿AT-Ⅲ活性，試劑為配套 AT-Ⅲ試劑1(凝血酶)、2(底物)和3(凝血酶溶劑)。

2.3 常規生化項目的檢測 用Olympus 2700全自動生化分析儀對所有肝素抗凝血血漿進行常規生化項目的測定，包括空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和同型半胱氨酸。

2.4 循環免疫復合物水平測定 參照Thomas等［3］的方法，根據說明書操作，應用商業化MicroVue CICRaji Cell Replacement EIA kit(Quidel)試劑盒測定血漿循環免疫復合物水平，每個樣本重復2次，求均值。

2.5 血漿TNF-α和IL-6水平 另1份肝素抗凝血漿置于-80℃冰箱中保存，采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Sigma)進行血漿TNF-α和IL-6水平測定，嚴格按照說明書操作。

2.6 外周血單核細胞分離 參照姚婷等［4］的方法，分離外周血單核細胞，即全血經Hanks液稀釋1倍后用淋巴細胞分離液常規分離，取單個核細胞層，Hanks液洗滌3次后，用10% 牛血清培養液調整細胞濃度為1×1010/L。將該濃度的外周血單個核細胞懸液加入96孔細胞培養板，每孔200 μL，置CO2培養箱中過夜，以使單個核細胞充分貼壁;用溫Hanks液洗滌3次，去除非黏附細胞，貼壁的即為單核細胞。經CD14單克隆熒光抗體染色后上流式細胞儀檢測，證實所得細胞80% 以上為單核細胞。

2.7 單核細胞數量及表型測定 獲取培養好的單核細胞，用分離緩沖液(PBS;20 mmol/L HEPES，pH 7.4;10 mmol/L EDTA;0.5%BSA)準備單細胞懸液，劇烈吹打。洗完后分別與 CD14、CD16、CD32、CD64抗體孵育，固定于1%多聚甲醛。參照 Scaldaferri等［5］的方法，用Coulter Epics XL流式細胞儀(Beckman Coulter)測定單核細胞數量及表型，進行定量流式細胞分析。細胞表面分子表達定量采用WinList 5.0軟件分析。

2.8 免疫復合物刺激對外周血單核細胞TNF-α和IL-6分泌的影響 參照Prehn等［6］的方法，制備板固定交聯人類IgG(復合IgG)，即12孔板中每孔加入1 mL溶于PBS(0.5 g/L)中的人類IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)共孵育過夜，PBS洗，與750 μL溶于 PBS(20 mg/L)中的小鼠抗人 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)共孵育1 h。包被好的孔板在加入細胞之前用PBS洗。將分離好的單核細胞用加入含有不同濃度(0.1～1 000 mg/L)Ig-IC復合物的12孔板刺激18 h，收集細胞上清，ELISA法測定上清液中TNF-α和IL-6水平。可溶性人類IgG(hIgG)作為對照。

2.9 TNF-α和IL-6對人腦血管內皮細胞AT-Ⅲ表達的影響 人腦血管內皮細胞(human brain vascular endothelial cells，HBVECs;源于胎腦血管，ScienCell提供)復蘇后置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養16 h，貼壁后以5 mL 0.25%胰酶消化，并加入約10 mL胰蛋白酶中和液，用滴管吹打，使細胞全部脫離培養瓶壁，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞，進行分裝傳代。將傳至4代的HBVECs分別接種于60 mm培養皿和6孔板中，當細胞生長至60% ～70%融合時，棄培養液，PBS清洗3遍后，加入TNF-α或IL-6刺激24 h，培養結束后離心取細胞上清液，參照Li等［7］的方法，用Western blotting法測定上清中AT-Ⅲ蛋白表達水平。

3 統計學處理

應用SPSS 11.5軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，多元線性相關分析用來評價血漿AT-Ⅲ活性與神經損傷程度、腦血管病危險因素(血壓、空腹血糖及血脂、同型半胱氨酸等)的關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 血漿AT-Ⅲ活性的變化

如圖1所示，與對照組［(97.10±11.63)%］相比，實驗組血漿 AT-Ⅲ活性明顯降低(84.96±10.37)%，二者差異有統計學意義(P＜0.05)。

Figure 1.Comparison of AT-Ⅲactivity in the plasma between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55.*P＜0.05 vs control group.圖1 實驗組與對照組血漿AT-Ⅲ活性比較

2 血漿AT-Ⅲ活性與神經系統功能損傷及腦梗死危險因素的相關性分析

將神經功能損傷積分、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、同型半胱氨酸作為自變量，將血漿AT-Ⅲ活性作為應變量，進行多元線性相關分析，研究發現腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性與神經功能損傷程度呈負相關(r=-0.53，P ＜0.05)，與收縮壓(r=-0.18)、舒張壓(r=-0.35)、空腹血糖(r=-0.29)、膽固醇(r=-0.79)、甘油三酯(r=-0.61)、低密度脂蛋白(r=-0.75)、同型半胱氨酸(r=-0.80)呈負相關(P＜0.05)，與高密度脂蛋白呈正相關(r=0.45，P ＜0.05)。

3 血漿TNF-α和IL-6水平的變化

與對照組［TNF-α(100.00±34.29)%和 IL-6(100.00±46.15)%］比較，實驗組的TNF-α和IL-6水平分別為(1 022.98±115.09)%和(505.20±57.57)%，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見圖2。

4 血漿免疫復合物水平的變化

如圖3所示，與對照組［(8.9±1.5)Eq/L］比較，實驗組免疫復合物水平明顯升高［(25.3±3.9)Eq/L，P ＜0.01］。

Figure 2.Comparison of TNF-α (A)and IL-6(B)levels in the plasma between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55. ＊＊P ＜0.01 vs control group.圖2 試驗組與對照組血漿TNF-α和IL-6水平比較

Figure 3.Comparison of immunocomplex level in the plasma between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55.＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 實驗組與對照組血漿免疫復合物水平比較

5 外周血單核細胞表面標志物的變化

流式細胞術檢測發現，對照組外周血CD14+CD16+單核細胞的百分比為(0.63±0.15)%，CD14+CD32+單核細胞為(5.32±0.98)%，CD14+CD64+單核細胞為(4.81±0.76)%，實驗組三者比例分別為(0.71±0.19)%、(5.51±0.27)% 和(8.79±0.42)%，其中CD14+CD64+的單核細胞比例與對照組比較明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，而CD14+CD16+和 CD14+CD32+單核細胞無明顯變化，見圖 4、5。

6 免疫復合物刺激對外周血單核細胞TNF-α和IL-6分泌的影響

與對照組比較，經免疫復合物刺激后，外周血單核細胞TNF-α和IL-6的分泌水平均呈濃度依賴性明顯升高，在1 000 mg/L hIgG時分別達到3 700 ng/L和1 100 ng/L(P ＜0.01)，見圖6。

Figure 4.Isolation and identification of monocytes in the peri-pheral blood.Left:negative control;right:CD14+cells.圖4 外周血單核細胞的分離和鑒定

Figure 5.Comparison of the monocyte surface markers in the peripheral blood between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55.*P＜0.05 vs control group.圖5 實驗組與對照組外周血單核細胞表面標志物比較

Figure 6.The levels of TNF-α (A)and IL-6(B)induced by stimulation of immunocomplex in the peripheral blood.Mean±SD.n=55.＊＊P＜0.01 vs control group.圖6 免疫復合物刺激對外周血單核細胞TNF-α和IL-6分泌的影響

7 TNF-α和IL-6對人腦血管內皮細胞AT-Ⅲ表達的影響

由圖7可知，與TNF-α或IL-6共孵育后，HBVECs AT-Ⅲ蛋白表達水平明顯下調(P＜0.05或P＜0.01)。

Figure 7.The effects of TNF-α (A)and IL-6(B)on the expression of AT-Ⅲ in human brain vascular endothelial cells.Mean ±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖7 TNF-α和IL-6對人腦血管內皮細胞AT-Ⅲ表達的影響

討 論

動脈粥樣硬化性腦梗死的發病機理主要是血管病變基礎上，內膜損傷破裂形成潰瘍后，血小板等血中有形成份黏附、聚集并釋放更多促凝血因子，同時血液成分中脂蛋白、膽固醇、纖維蛋白原等含量增加，使血黏度增高，血流緩慢、凝固性增高，局部腦組織出現急性缺血癥狀。因此動脈粥樣硬化性腦梗死的發生與凝血和抗凝系統的失衡有關，而對凝血系統起制約作用的抗凝系統在動脈粥樣硬化性腦梗死的發病中有重要意義。

AT-Ⅲ是主要由肝臟合成的單鏈糖蛋白，并作為絲氨酸蛋白酶抑制物，作用于諸多凝血因子含絲氨酸殘基的活性中心，為血漿生理性抑制凝血的關鍵物質，參與保持體內抗凝血功能和纖溶系統與凝血系統的動態平衡［8］，正常情況下約占血漿總抗凝血酶活性的50% ～70%［9］。當血漿中AT-Ⅲ活性小于70%時，血栓形成的危險性就會增加。有報道指出，冠狀動脈粥樣硬化可使血管內皮細胞大量受損，故必累及抗凝因子，而其中以抗凝物質減低居多［10］。本研究發現，與冠狀動脈粥樣硬化相似，動脈粥樣硬化性腦梗死患者急性期AT-Ⅲ活性明顯降低，可能與凝血酶大量活化，凝血功能亢進消耗有關，加之長期的動脈粥樣硬化和高血壓等危險因素，使血管內皮細胞不同程度的受損，抗凝因子合成減少，故AT-Ⅲ活性的下降與消耗及合成減少有關。這一結果與最近一項早期應用AT-Ⅲ可降低小鼠腦缺血程度、保護腦神經的研究［11］結果一致;而且血漿AT-Ⅲ活性與腦梗死危險因素相關性分析發現，血漿AT-Ⅲ活性與收縮壓、舒張壓、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、同型半胱氨酸呈負相關，與高密度脂蛋白呈正相關。分析其中原因可能為高血壓可以導致小動脈的損傷，高血糖、高膽固醇、高甘油三酯和低密度脂蛋白伴隨的動脈粥樣硬化也會損傷小血管。因此，AT-Ⅲ可能是動脈粥樣硬化性腦梗死的危險因子，它反映了動脈粥樣硬化的程度和其它原因(高血壓等)所致的小血管損傷。實驗中還發現，腦梗死患者神經損傷程度與AT-Ⅲ活性也呈負相關，檢測AT-Ⅲ活性，可有助于病情監測及指導臨床治療。

越來越多的證據表明，炎癥和凝血兩大系統間存在很強的相互作用和廣泛的交互通話［12］，其中促炎細胞因子是最重要的連接炎癥和凝血的橋梁。TNF-α主要由巨噬細胞、NK細胞和T細胞產生，主要和局部炎癥有關，實驗研究證實了其在炎癥誘導凝血激活的過程中的重要核心地位:將TNF-α注入人體后檢測多種凝血指標，結果顯示凝血途徑被激活［13］。IL-6是一種也可以激活凝血系統的促炎細胞因子［14］，抗IL-6的抗體可以阻止系統感染導致的凝血異常［15］。本研究發現，血漿中的TNF-α和IL-6水平在試驗組明顯升高，可能是由于局部不穩定斑塊中升高的TNF-α和IL-6表達水平導致血漿的TNF-α和IL-6水平升高［16］，也可能是由血液中某些細胞直接產生，提示這些促炎細胞因子水平的升高可能與降低的AT-Ⅲ活性有關。

炎癥過程和免疫反應是動脈粥樣硬化斑塊的核心病理過程［17-18］。組織病理學結果進一步顯示:斑塊中單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞的激活和復雜相互作用，在動脈粥樣硬化和斑塊不穩定相關的炎癥過程中發揮重要作用［19］，這種復雜的作用最終引起動脈粥樣硬化斑塊破裂和急性冠脈綜合征。在本實驗中發現，血漿病理產物免疫復合物水平也明顯升高，為了進一步闡明免疫復合物和細胞因子在動脈粥樣硬化性腦梗死患者AT-Ⅲ活性變化中的關系及其機制，我們分離外周血單核細胞并對其表面標志物進行分析，結果發現，CD14+CD16+單核細胞和CD14+CD32+單核細胞數量在對照組和實驗組無明顯差別，而實驗組CD14+CD64+單核細胞數量明顯升高，因此我們推測在腦梗死患者，免疫復合物可能通過結合CD14+CD64+的單核細胞，刺激其產生大量促炎細胞因子，導致AT-Ⅲ活性改變。

為了進一步驗證上述假設，深入探討AT-Ⅲ在腦梗死患者變化的機制，我們在體外模擬免疫復合物，并觀察其對外周血單核細胞TNF-α和IL-6分泌的影響，結果發現，經免疫復合物刺激后，這些促炎細胞因子的水平均明顯升高，通過進一步檢測TNF-α和IL-6對人腦血管內皮細胞AT-Ⅲ表達的影響，發現二者均能抑制AT-Ⅲ表達。因此，我們認為動脈粥樣硬化性腦梗死患者升高的促炎細胞因子主要來源于血液中受刺激的的單核細胞，這些細胞因子使血管內皮細胞不同程度的受損，抗凝因子合成減少，可能是血漿AT-Ⅲ活性下降的主要原因。

綜上所述，AT-Ⅲ活性在動脈粥樣硬化性腦梗死患者血漿中明顯降低，是腦梗死發病的危險因素之一，且與病情嚴重程度相關，其可能的機制是免疫復合物通過CD14+CD64+單核細胞介導促炎細胞因子產生，并進一步損傷腦血管內皮細胞，抑制AT-Ⅲ合成。因此，升高AT-Ⅲ活性對缺血腦組織具有保護作用。

［1］ Hermus L，Schuitemaker JH，Tio RA，et al.Novel serum biomarkers in carotid artery stenosis:Useful to identify the vulnerable plaque?［J］.Clin Biochem，2011，44(16):1292-1298.

［2］ Lin HS，Tsai TH，Liu CF，et al.Serum level and prognostic value of neopterin in patients after ischemic stroke［J］.Clin Biochem，2012，45(18):1596-1601.

［3］ Thomas BN，Diallo DA，Noumsi GT，et al.Circulating immune complex levels are associated with disease severity and seasonality in children with malaria from Mali［J］.Biomark Insights，2012，7:81-86.

［4］ 姚 婷，王慧娟，秦浚川，等.M-CSF和IL-10對人單核細胞表面分子表達的影響［J］.上海免疫學雜志，2003，23(6):374-377.

［5］ Scaldaferri F，Sans M，Vetrano S，et al.Crucial role of the protein C pathway in governing microvascular inflammation in inflammatory bowel disease［J］.J Clin Invest，2007，117(7):1951-1960.

［6］ Prehn JL，Thomas LS，Landers CJ，et al.The T cell costimulator TL1A is induced by FcγR signaling in human monocytes and dendritic cells［J］.J Immunol，2007，178(7):4033-4038.

［7］ Li YY，Lu S，Li K，et al.Down-regulation of HSP60 expression by RNAi increases lipopolysaccharide-and cerulein-induced damages on isolated rat pancreatic tissues［J］.Cell Stress Chaperones，2010，15(6):965-975.

［8］ Fourrier F，Chopin C，Goudemand J，et al.Septic shock，multiple organ failure，and disseminated intravascular coagulation.Compared patterns of antithrombin III，protein C，and protein S deficiencies［J］.Chest，1992，101(3):816-823.

［9］ 蘇學飛，黃秋蓮.凝血抑制物檢測在血栓性疾病的價值［J］.國際醫藥衛生導報，2006，12(7):80-81.

［10］董存巖，周志芳.肝病患者血漿AT-Ⅲ活性檢測及意義［J］.實用預防醫學，2004，11(2):264-265.

［11］ Cuomo O，Pignataro G，Gala R，et al.Antithrombin reduces ischemic volume，ameliorates neurologic deficits，and prolongs animal survival in both transient and permanent focal ischemia［J］.Stroke，2007，38(12):3272-3279.

［12］ Z?ller B，Li X，Sundquist J，et al.Autoimmune diseases and venous thromboembolism:a review of the literature［J］.Am J Cardiovasc Dis，2012，2(3):171-183.

［13］ Olejár T，Matej R，Zadinová M，et al.Expression of proteinase-activated receptor 2 during taurocholate-induced acute pancreatic lesion development in Wistar rats［J］.Int J Gastrointest Cancer，2001，30(3):113-121.

［14］Kerr R，Stirling D，Ludlam CA.Interleukin 6 and haemostasis［J］.Br J Haematol，2001，115(1):3-12.

［15］Levi M，van der Poll T，ten Cate H，et al.The cytokinemediated imbalance between coagulant and anticoagulant mechanisms in sepsis and endotoxaemia［J］.Eur J Clin Invest，1997，27(1):3-9.

［16］ Hermus L，Lefrandt JD，Tio RA，et al.Carotid plaque formation and serum biomarkers［J］.Atherosclerosis，2010，213(1):21-29.

［17］Yip HK，Sun CK，Chang LT，et al.Strong correlation between serum levels of inflammatory mediators and their distribution in infarct-related coronary artery［J］.Circ J，2006，70(7):838-845.

［18］Yip HK，Wang PW，Chang LT，et al.Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 gene polymorphism associated with ST-segment elevation acute myocardial infarction［J］.Circ J，2007，71(8):1213-1218.

［19］ Sugioka K，Naruko T，Hozumi T，et al.Elevated levels of neopterin are associated with carotid plaques with complex morphology in patients with stable angina pectoris［J］.Atherosclerosis，2010，208(2):524-530.