Akt激酶抑制劑MK-2206誘導U2OS人骨肉瘤細胞凋亡與自噬*

王雪瑩， 李照梅， 周運生， 郭文莉， 王鳳澤△

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路參與細胞的增殖、凋亡和分化等多種生命活動過程［1-2］。PI3K和其下游分子蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)所構成的信號途徑與腫瘤細胞的凋亡、遷移、自噬以及細胞外基質的降解等關系密切［3］。抑制PI3K/Akt途徑的過度活化可誘導細胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長［4］。因此，PI3K/Akt已經成為一個很有希望的抗腫瘤治療靶點。MK-2206是Akt的新型抑制劑，表現出良好的抑制多種腫瘤的活性［5-6］。本研究以骨肉瘤細胞U2OS為實驗材料，檢測MK-2206對骨肉瘤細胞凋亡和自噬的影響，為MK-2206的臨床用藥提供理論依據。

材料和方法

1 細胞株和主要試劑

人骨肉瘤細胞株U2OS購自上海中科院細胞庫，生長于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2條件下培養。

MK-2206購自Selleck Chemicals;DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco;MTT和氯喹購自Sigma;DNA片段末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自Roche;ECL試劑盒購自Thermo Scientific Pierce;Caspase-3抗體、caspase-9抗體、PARP抗體和Atg5抗體購自Cell Signaling Technology;β-actin和LC3-II抗體購自Sigma;Ⅱ抗均購自北京中杉金橋。

2 方法

2.1 MTT法測定細胞活性 將U2OS細胞接種于96孔板中，加入不同劑量的MK-2206處理24 h，對照組加入DMSO;終止培養前4 h加20 μL MTT(5 g/L)于各個孔中，吸去培養液并加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min后在490 nm波長下測定吸光度值。

2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡 細胞經MK-2206處理24 h后，PBS洗滌細胞3次，接著4℃固定細胞1 h，0.1%Triton X-100打孔2 min。然后按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行凋亡染色，倒置熒光顯微鏡觀察細胞TUNEL染色結果。

2.3 免疫印跡分析 細胞用RAPI裂解液冰上裂解20 min，然后4℃、13 000×g離心20 min，收集上清定量。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE，然后電轉移至硝酸纖維素膜上，膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗室溫孵育2 h，接著加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實驗重復3次。

2.4 細胞內GFP-LC3融合蛋白的表達 將GFPLC3質粒和Lipofectamine 2000以適當的比例稀釋于無血清Opti-MEM培養基中，混勻后室溫孵育30 min，然后加入經Opti-MEM洗滌后的U2OS細胞中。在5%CO2孵箱內37℃孵育6 h后更換新的含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。轉染24 h后，加入不同濃度的MK-2206繼續處理24 h，然后棄去培養液，用PBS洗滌細胞2次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件分析。組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MK-2206顯著抑制U2OS細胞活性

用不同劑量的MK-2206處理U2OS細胞24 h后，細胞活性受到明顯的抑制，且MK-2206對U2OS細胞活性的抑制作用呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1.MK-2206 reduced the viability of U2OS cells.The cells were seeded at a density of 1×109cells/L in 96-well culture plates at 37℃for 1 d.After 24 h of incubation，the cells were incubated with MK-2206 for 24 h and then processed for MTT assay.Mean±SD.n=6.圖1 MK-2206降低U2OS細胞的活力

2 MK-2206誘導U2OS細胞發生凋亡

TUNEL結果顯示，骨肉瘤細胞U2OS經MK-2206作用24 h后，細胞發生明顯的凋亡現象，見圖2。

Figure 2.Effect of MK-2206 on the apoptosis of U2OS cells.The cells were treated with different concentrations of MK-2206 for 24 h.The apoptosis was analyzed by TUNEL staining.The results showed the presence of fragmented DNA(TUNEL-positive staining，bright green in color)in MK-2206-treated U2OS cells.圖2 MK-2206誘導U2OS細胞發生凋亡

免疫印跡結果發現，MK-2206能夠促進U2OS細胞內caspase-3、caspase-9和PARP的活性切割，見圖3，表明 MK-2206誘導骨肉瘤細胞的凋亡與激活caspases家族成員的活性密切相關。

Figure 3.MK-2206 treatment induced the cleavage of caspase-3，caspase-9 and PARP at 24 h.β-actin was used as a control.CF:cleaved fragment.圖3 MK-2206誘導caspase-3、caspase-9和PARP發生活性切割

3 MK-2206誘導U2OS細胞發生自噬

轉染GFP-LC3質粒的U2OS細胞經MK-2206作用后，細胞內LC3呈現明顯的點狀聚集，而對照組綠色熒光呈彌散分布，見圖4。

用免疫印跡法檢測了MK-2206對骨肉瘤細胞內LC3-II和Atg5蛋白表達量的影響，發現不同濃度的MK-2206處理U2OS細胞后，與對照組相比，LC3-II和Atg5的蛋白表達水平明顯增多，見圖5。

4 阻斷自噬促進MK-2206對U2OS細胞活性的抑制作用

氯喹是一種自噬抑制劑，能有效抑制細胞自噬的發生。骨肉瘤細胞經氯喹預處理后，MK-2206對U2OS細胞活性的抑制作用進一步增強，見圖6。

討 論

我們前期研究發現Akt抑制劑MK-2206能夠誘導肝癌細胞發生凋亡，但其在骨肉瘤細胞中的抑癌活性未見報道。本研究在檢測MK-2206降低U2OS細胞活性并誘導細胞發生凋亡的同時探討了MK-2206對細胞自噬的影響。本研究結果表明，MK-2206能夠抑制骨肉瘤細胞U2OS的細胞活性，且抑制作用呈劑量依賴性;經 MK-2206作用24 h后，U2OS細胞發生明顯的凋亡現象，調控細胞凋亡線粒體途徑的caspases家族部分蛋白出現明顯的活性切割。同時，我們觀察到自噬標記分子LC3-II的表達水平升高，提示MK-2206可能誘導細胞發生自噬;GFP-LC3細胞內的點狀分布進一步證實了MK-2206能夠誘導骨肉瘤細胞自噬的發生。

Figure 4.Induction of autophagy in MK-2206-treated U2OS cells.The formation of LC3-positive vesicles in MK-2206-treated and GFP-LC3-transduced cells was observed.MK-2206 induced the redistribution of GFP-LC3 from diffused distribution(control cells)to punctate structures(MK-2206-treated cells).圖4 MK-2206對U2OS細胞自噬的誘導作用

Figure 5.MK-2206 increased the expression of LC3-II and Atg5 in the U2OS cells.Cells were treated with indicated concentrations of MK-2206 for 24 h and then subjected to detect the levels of LC3-II and Atg5 by Western blotting.Bands were analyzed by Glyco Band-Scan software.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖5 MK-2206促進U2OS細胞內LC3-II和Atg5的表達

Figure 6.The effects of autophagic inhibitor chloroquine(CQ)on MK-2206-reduced cell viability.The cells were treated with 20 μmol/L CQ for 2 h before the addition of MK-2206 at concentration of 10 μmol/L(MK10)or 20 μmol/L(MK20).The cell viability was determined by MTT assay after 24h.Mean±SD.n=6.圖6 MK-2206聯合自噬抑制劑氯喹對細胞活性的影響

細胞自噬是真核細胞所特有的一種生物學過程，是細胞內的物質成分利用溶酶體被降解過程的統稱［7-8］。細胞發生自噬時，自噬體與溶酶體相結合形成自噬溶酶體，后者可降解細胞內受損的細胞器，同時循環利用降解的產物，為細胞代謝提供營養物質及原料。近年來的研究顯示，自噬在腫瘤的預防治療中有重要作用。自噬與細胞凋亡關系復雜，表現在自噬既可誘導凋亡，又可拮抗細胞的凋亡，自噬的這種雙重作用機制使其在腫瘤細胞中的功能尤為重要［9-10］。

為了探討MK-2206誘導的U2OS細胞自噬與細胞活性的相關性，我們應用自噬特異抑制劑氯喹來觀察自噬的發生對MK-2206抑制細胞活性的影響。實驗結果可見，經氯喹預處理后，MK-2206對細胞活性的抑制作用明顯增強，表明MK-2206誘導的細胞自噬可能對U2OS細胞起保護作用。

綜上所述，MK-2206抑制人骨肉瘤U2OS細胞的活性與其促進細胞凋亡及誘導自噬相關。目前，自噬與腫瘤發生的相關性尚未完全闡述清楚，對自噬的深入研究很可能為癌癥的治療提供新的途徑。MK-2206和自噬抑制劑的聯合應用可能為骨肉瘤的臨床治療提供新策略。

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