高遷移率族蛋白B1對大鼠局灶腦缺血/再灌注后大腦皮質梗死周圍區神經干細胞增殖的影響*

李 滿， 羅 勇， 李 圓， 孫 麟

腦缺血/再灌注損傷后，腦內會出現神經干細胞的自發增殖。既往研究證實，神經干細胞的自發增殖可發生在海馬齒狀回顆粒細胞下層、側腦室室管膜下區和大腦皮質梗死周圍區，并于7～10 d達增殖的高峰［1-3］。然而腦缺血/再灌注損傷后誘導神經干細胞自發增殖的內在原因一直未能明確。已知腦缺血/再灌注損傷可刺激星形膠質細胞和小膠質細胞活化并釋放炎癥因子高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)參與后期的炎癥反應［4］。但近期研究發現，腦缺血后HMGB1的釋放有利于血管內皮細胞的增殖，并促進血管再生［5］。在斑馬魚腦發育的過程中，HMGB1可促進神經前體細胞的增殖和前腦的形成［6］，而在腦出血后，HMGB1可以促進血腫周圍神經干細胞的增殖和血管再生［7］。那么腦缺血/再灌注后HMGB1在受損局部的釋放是否也參與了促進腦缺血后神經干細胞自發增殖，目前尚未見相關報道。本研究通過制作大鼠局灶腦缺血/再灌注模型，應用RNA干擾技術抑制腦內HMGB1蛋白表達，采用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromo-2′-deoxyuridine，BrdU)體內標記的方法，檢測神經干細胞增殖高峰期再灌注7 d時大腦皮質梗死周圍區BrdU和神經巢蛋白(nestin)雙標記陽性細胞，判斷局灶腦缺血/再灌注損傷后HMGB1蛋白表達是否有促進大腦皮質梗死周圍區神經干細胞增殖的作用。

材料和方法

1 動物與分組

清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重250～300 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0001。將大鼠隨機分為假手術組、局灶腦缺血/再灌注模型組(模型組)、局灶腦缺血/再灌注+HMGB1 shRNA干擾組(RNA干擾組)和局灶腦缺血/再灌注+陰性對照shRNA干擾組(陰性干擾組)，每組12只。

2 主要試劑

BrdU購自 Sigma;兔抗大鼠 HMGB1購自 Abcam;小鼠抗大鼠膠質細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)購自CST;兔抗大鼠巢蛋白(nestin)購自武漢三鷹生物技術有限公司;小鼠抗BrdU購自Abcam;山羊抗小鼠Alexa Flour 647Ⅱ抗購自碧云天生物制劑公司;山羊抗兔TRITCⅡ抗、β-actin和辣根過氧化物酶標記的抗兔/鼠Ⅱ抗均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;攜帶HMGB1 shRNA和陰性對照shRNA的慢病毒載體由上海吉凱基因股份有限公司合成;Western blotting相關試劑購自碧云天生物制劑公司。

3 主要方法

3.1 大鼠局灶腦缺血/再灌注模型的制備 根據Longa等［8］的經驗，采用改良線栓法制備右側大腦中動脈局灶腦缺血/再灌注模型。大鼠經3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.1 mL/kg)后，仰臥位固定于操作臺上，備皮、消毒;經頸部正中切口依次暴露右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈顱外段;斷離頸內、外動脈分支及交通支，距頸外動脈分叉約0.5 cm處灼燒斷離頸外動脈，在殘端做一環形切口;取一長35 mm、直徑為0.23 mm的尼龍釣絲，在一端約5 mm長度上均勻涂一層聚氨酯，使其直徑達0.25～0.26 mm左右，晾干后備用;將線栓由頸外動脈經切口向頸內動脈顱內方向插入17～20 mm，遇阻力表明線栓頭端已通過大腦中動脈起始部，實現右側大腦中動脈缺血;清理手術野，全層縫合皮膚。缺血1 h后拔回線栓至頸外動脈殘端，實現再灌注。假手術組僅將線栓插入頸內動脈而不栓塞大腦中動脈。大鼠清醒后行神經功能學評分，參照Longa 5分制評分標準，評分2～3分的大鼠為造模成功，被用于實驗。術中出血較多、出現呼吸困難、取腦時發現蛛網膜下腔出血及提前死亡者剔除，并補足相應只數。

3.2 慢病毒介導的腦內RNA干擾 攜帶HMGB1 shRNA的慢病毒序列如下:5′-GATCCCGAAGCACCCGGATGCTTCTTTCAAGAGAAGAAGCATCCGGGTGCTTCTTTTTTGGAAA-3′［3］。陰性對照 shRNA 序列對目前已知的mRNA無任何干擾作用(序列由上海吉凱基因股份有限公司提供)。再灌注2 d后，分別將RNA干擾組和陰性干擾組SD大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，置于立體定位儀(Stoslting)上，見圖1。將攜帶HMGB1 shRNA和陰性對照shRNA的慢病毒分別注射于RNA干擾組和陰性干擾組大鼠右側側腦室。前囟被定為立體定位原點，前囟向后1.5 mm，向右旁開1.0 mm，深度為顱骨下3.5 mm。注射速度為0.5 μL/min，注射總體積為每只 6 μL，病毒滴度為2×1012TU/L。注射后局部留針5 min后拔針。再灌注7 d后，按照Hayakawa等［5］的方法，采用免疫熒光雙標記HMGB1/GFAP和免疫印跡的方法檢測RNA干擾的結果。

3.3 BrdU標記 采用腹腔注射BrdU的方法對再灌注后腦內神經干細胞進行標記。于再灌注5 d開始給予BrdU(50 mg/kg)，腹腔注射每天2次，連續2 d，見圖1。行4%多聚甲醛灌流后，取大鼠(n=6)腦組織按10 μm厚度經行冠狀位切片后保存于-80℃。

Figure 1.The time points of lentivirus injection and BrdU injection in focal cerebral ischemia/reperfusion rats.圖1 大鼠局灶腦缺血/再灌注模型注射慢病毒及BrdU時間示意圖

3.4 組織免疫熒光雙標記染色 組織切片放于1%Triton X-100 PBS液中，37℃通透30 min，在pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中微波修復20 min，自然冷卻至室溫;BrdU染色需繼續進行DNA變性，用2 mol/L HCl 37℃孵育30 min，然后用pH 8.5的硼酸鈉溶液沖洗10 min。PBS液沖洗15 min。置于5%山羊血清中37℃封閉1 h。進行免疫雙標，分別加Ⅰ抗nestin(1∶50)/BrdU(1∶20)和 GFAP(1∶300)/HMGB1(1∶100)4℃過夜。PBS沖洗后，加Ⅱ抗山羊抗兔TRITC(1∶50)和山羊抗小鼠 Alexa Flour 647(1∶200)37℃孵育2 h。抗淬滅封片劑封片。用配備Fluoview FVX共聚焦掃描頭(Leica)的Olympus IX70倒置顯微鏡(Olympus)采集圖像。每組6只大鼠，每只大鼠取非連續的3張切片，每張切片選取2個視野計數細胞。

3.5 Western blotting 每組6只大鼠用于Westren blotting檢測。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后斷頭取腦，取梗死灶周圍的大腦皮質放入勻漿器，按每20 mg組織加150 μL RIPA裂解液(含PMSF)的比例，在冰浴條件下加入RIPA裂解液，冰浴裂解30 min，12 000×g離心15 min，取上清液;用BCA蛋白定量法檢測所提蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣量45 μg，電泳分離蛋白條帶，電轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉37℃封閉90 min，加HMGB1Ⅰ 抗(1∶1 000)，內參照選用 β-actin(1∶1 000)，4℃過夜。辣根過氧化物酶標記的抗兔/鼠Ⅱ 抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h后用ECL發光液顯像。利用Bio-Rad apparatus顯影儀顯影，Quantity One 4.6.2軟件分析圖像。

4 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。各組比較采用方差分析;若各組方差齊，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗;若各組方差不齊，組間兩兩比較采用Tamhane檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腦缺血/再灌注7 d后大鼠大腦皮質梗死周圍區內HMGB1蛋白的表達

采用免疫熒光雙標記GFAP(星形膠質細胞標記物，藍色)和HMGB1(紅色)的表達后顯示:假手術組內可見HMGB1蛋白和GFAP陽性細胞均散在分布于腦組織中，且僅有少量HMGB1的表達與GFAP陽性細胞相重疊;與假手術組比較，模型組HMGB1蛋白在梗死周圍區表達增多，同時伴有GFAP陽性細胞數明顯增加，且表達HMGB1的GFAP陽性細胞明顯增多;而與模型組比較，RNA干擾組HMGB1蛋白表達明顯被抑制;而陰性干擾組與模型組比較，HMGB1蛋白表達及GFAP陽性細胞均無明顯差別，見圖2A。提示再灌注7 d后梗死周圍區HMGB1蛋白的表達增多，并伴有星形膠質細胞的增多;RNA干擾可以有效抑制HMGB1的表達和星形膠質細胞的局部增殖。

Western blotting檢測皮質梗死周圍區HMGB1表達結果顯示:與假手術組比較，模型組和陰性干擾組HMGB1蛋白表達明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，RNA干擾組 HMGB1蛋白的表達明顯降低(P＜0.05)。這提示再灌注7 d后HMGB1蛋白在大腦皮質梗死周圍區的表達明顯增多，RNA干擾可以有效抑制HMGB1蛋白表達，見圖2B。

2 BrdU/nestin雙標大腦皮質梗死周圍區神經干細胞

免疫熒光雙標記BrdU/nestin結果顯示:假手術組大腦皮質內幾乎沒有被標記的陽性細胞;與假手術組相比，模型組大腦皮質梗死周圍區可見大量BrdU/nestin陽性細胞(P＜0.05);而RNA干擾組大腦皮質內的BrdU/nestin陽性細胞明顯減少(P＜0.05);陰性干擾組的BrdU/nestin陽性細胞與模型組無明顯差別(P＞0.05)。提示模型組大腦皮質梗死區周圍有大量神經干細胞增殖，而RNA干擾組當大腦皮質內HMGB1蛋白表達被抑制時神經干細胞的增殖能力也明顯減弱，見圖3。

Figure 2.HMGB1 expression in peri-infarction cortex 7 d after reperfusion.A:double-immunofluorescence labeling with HMGB1(red)and GFAP(blue)in the peri-infarction cortex;B:Western blotting showed the HMGB1 protein expression in the peri-infarction cortex.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖2 再灌注7 d后HMGB1在大腦皮質梗死周圍區的表達

Figure 3.BrdU(blue)/nestin(red)positive cells in peri-infarction cortex 7 d after reperfusion.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖3 再灌注7 d后大腦皮質梗死周圍區的BrdU/nestin陽性細胞表達

討 論

腦缺血/再灌注損傷后，海馬顆粒細胞下層、側腦室周帶及腦梗塞灶的周圍都會出現不同程度的內源性神經干細胞增殖，這些增殖的神經干細胞可以遷移到梗死區，并分化為神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞等，參與組織結構重建和神經功能的修復［1-3］。但目前關于腦缺血/再灌注損傷后導致神經干細胞自發增殖的內在原因尚未明確。既往通過體外培養星形膠質細胞模擬腦缺血/再灌注發現，經過氧糖剝奪/復氧復糖處理后的星形膠質細胞可以增殖、活化并向有壞死細胞的部位聚集［9］。而腦損傷后神經干細胞也被激活，并遷移到有星形膠質細胞活化的損傷區［10］。因此腦缺血/再灌注后星形膠質細胞在受損區的活化和聚集可能對神經干細胞的增殖具有促進作用。但既往僅通過體外實驗證實離體星形膠質細胞有向壞死細胞局部聚集的現象［9］，而無在體實驗的研究。本實驗通過免疫熒光標記星形膠質細胞標記物GFAP觀察到再灌注7 d時大腦皮質梗死周圍區星形膠質細胞明顯增多，表明該部位有星形膠質細胞聚集，該結果與既往離體實驗結果一致，進一步通過在體實驗證實腦缺血/再灌注后星形膠質細胞在皮質梗死周圍區聚集的現象。

既往的研究結果證實，腦缺血/再灌注后HMGB1在受損部位表達呈現一個先降低后升高的動態變化過程。既往通過對大鼠局灶腦缺血/再灌注模型的研究發現，再灌注1 d時HMGB1的表達明顯下降，之后逐漸升高，至4 d時接近正常水平，之后逐漸高于正常水平，并持續數天至數周［3-4］。通過細胞類型的定位研究發現再灌注2 d開始，HMGB1就主要由星形膠質細胞、小膠質細胞和血管內皮細胞分泌［11］。本實驗通過Western blotting檢測證實，再灌注7 d HMGB1蛋白在大腦皮質梗死周圍區的表達明顯高于假手術組;結合免疫熒光雙標檢測發現，假手術組HMGB1蛋白主要表達于星形膠質細胞以外的其它類型的細胞，而模型組HMGB1蛋白則主要表達于星形膠質細胞，該結果中HMGB1表達的時間點變化規律及表達部位與既往的研究結果相符［4-5，11］。

HMGB1在腦缺血/再灌注后的釋放不僅有加重損傷的作用，同時還有促進修復的作用。已有的研究主要關注于腦缺血/再灌注損傷后HMGB1對腦組織的損傷作用，并有研究證實HMGB1的釋放可以促進神經元凋亡［12］、腦梗區的炎癥反應［13］及對血腦屏障的損傷［14］。但最近的研究發現HMGB1在腦缺血損傷后有促進組織修復的作用，Hayakawa等［5］通過離體實驗和在體實驗均證實星形膠質細胞釋放HMGB1可以促進血管內皮祖細胞的增殖，并且推斷HMGB1的釋放可以促進神經血管單元的重建和腦梗后神經功能的恢復。Meneghini等［15］通過體外實驗證實HMGB1通過與神經干細胞表面的晚期糖基化終末產物受體結合可以促進神經干細胞增殖。Lei等［7］通過使用膠原酶誘導腦出血模型的研究發現，HMGB1可以促進血腫周圍神經干細胞的增殖和血管再生。但目前尚未見HMGB1在腦缺血/再灌注損傷后促進神經干細胞增殖的報道。本實驗中，我們通過選取腦缺血后神經干細胞增殖的高峰期再灌注7 d作為檢測時點［1-3］，通過使用RNA干擾技術抑制皮質內HMGB1表達發現，皮質梗死周圍區神經干細胞的增殖受到抑制，說明腦缺血再灌注損傷后HMGB1在腦內的表達有促進損傷部位神經干細胞的增殖作用。結合既往的研究結果［4］，我們進一步推斷局灶腦缺血/再灌注損傷后HMGB1在腦梗周圍區表達可能通過促進血管再生和神經再生共同促進腦組織結構重建和神經功能恢復。但局部增殖的神經干細胞是否可以在后期繼續向神經元分化，并與周圍的神經進一步形成突觸連接尚有待進一步研究。

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