TMEM16A鈣激活氯離子通道在Fisher大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞的表達及其電生理特性研究*

郝 峰， 白雪松， 鞠曉紅， 方 芳， 藏雨軒， 朱杭飛， 向國艷， 張雲喬， 袁忠海△

鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一類在哺乳動物細胞中廣泛表達的離子通道蛋白，因其通過胞漿中游離鈣離子而激活，并跨膜轉運體內含量最豐富的陰離子氯離子而命名為鈣激活氯離子通道［1］。鈣激活氯離子通道廣泛地存在于各種興奮性和非興奮性細胞上，在多種生理功能中發揮重要作用:例如，分泌蛋白及鹽的跨上皮轉運、阻止卵母細胞多重受精、嗅覺的信號傳導、平滑肌收縮、神經元興奮和心臟動作電位的復極化等;同時鈣激活氯離子通道也在多種病理過程中扮演重要角色，是腹瀉、高血壓、囊性纖維化和某些特定腫瘤等疾病潛在的藥物靶點［1-3］。早在上世紀80年代，科學家就在非洲爪蟾卵母細胞上記錄到了經典的鈣激活氯離子通道電流，證實了鈣激活氯離子通道的存在。新近研究證實跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)是鈣激活氯離子通道的分子基礎［4-6］。雖然目前人們對鈣激活氯離子通道已經有了一定了解，但對于鈣激活氯離子通道確切的生理和病理意義的認識還十分有限。為了深入研究鈣激活氯離子通道確切的生理功能及其在某些疾病病理過程中的作用，本研究根據確定的TMEM16A序列，構建其真核表達載體，將其轉染入適合高通量篩選的Fisher大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞(Fischer rat thyroid follicular epithelial cells，FRT細胞)中，獲得穩定表達TMEM16A的FRT細胞克隆，并觀察其在FRT細胞表達和研究其電生理特性。

材料和方法

1 細胞株和動物

FRT細胞由大連醫科大學麻彤輝教授饋贈，采用F-12基本培養基、10% 胎牛血清、37℃和5%CO2培養箱內(Heraeus)培養。6月齡野生型C57BL/6J小鼠由大連醫科大學麻彤輝教授饋贈。

2 主要試劑

F-12基本培養基、兔抗V5多克隆抗體、Cy3標記的羊抗兔 IgGⅡ抗、尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、HEPES、NMDG 和 CsCl購自 Sigma;胎牛血清購自 Gibco;TRIzol、轉染試劑 Lipofectamine 2000、Lipofectamine LTX、殺稻瘟菌素、鈣離子載體 ionomycin、SuperScriptⅢ試劑盒和真核表達載體pUB6/V5-His B購自Invitrogen;真核表達載體pcDNA3.1-YFPH148Q/I152L為本實驗室前期構建;Expand Long Template PCR System購自Roche;限制性內切酶購自TaKaRa;λHind III fragments、φX174 DNA 核酸分子量標準品和T4連接酶購自Promega;質粒提取試劑盒購自Axygen;DNA凝膠回收試劑盒購自Qiagen;酵母提取物和蛋白胨購自Oxford;其它生化試劑均為進口分裝或購自上海生工;所用引物由上海生工合成。

3 主要方法

3.1 TMEM16A真核表達載體的構建和鑒定 取C57BL/6J小鼠視網膜 100 mg，液氮研磨后加入TRIzol溶液3 mL，按照試劑盒說明書提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA完整性，NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific)檢測提取核酸的濃度和純度。GenBank數據庫獲得的小鼠 TMEM16A(NM_178642.4)序列編碼區全長2 871 bp，根據全長設計特異性引物序列，下游引物去除終止密碼子，以使其C末端的V5表達，并加入保護堿基和相應的酶切位點 BamH I和 Xba I，上游引物 5′-ctggatccatgagggtccccgagaagtac-3′，下 游 引 物 5′-gatctagactcagcgcgtccccatggtactc-3′。參照試劑盒說明以總 RNA為模板進行逆轉錄反應合成cDNA，以此cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，BamH I和Xba I雙酶切pUB6/V5載體和回收的PCR產物，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，回收產物在T4連接酶作用下于16℃連接反應12 h制備克隆連接液，將重組質粒轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞，以含有氨芐青霉素的LB選擇性固體培養基培養，次日挑取陽性克隆至5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養液，搖床(37℃、200 r/min)12 h后提取質粒，酶切鑒定正確后進一步測序鑒定，-20℃冰箱保存備用。

3.2 穩定表達TMEM16A細胞株的建立 轉染前，將10 cm2細胞培養板中長勢良好的FRT細胞接種到6孔板中，16 h后細胞匯合度達 90%。取TMEM16A 真核表達載體2、4、8 μg，分別與10 μL Lipofectamine 2000混合，并輕彈混勻，室溫下孵育15 min。將DNA與Lipofectamine 2000混合液加入匯合度為90%的FRT細胞的6孔板中，混勻，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養。培養6 h后棄含有DNA與Lipofectamine 2000的培養液體，每孔加入2 mL的完全培養液繼續培養。48 h后免疫熒光實驗檢測TMEM16A的表達情況和轉染效率。以轉染效率高的DNA和Lipofectamine 2000比例將TMEM16A轉染至FRT細胞，48 h后消化細胞，以1∶5∶10的比例將細胞分別接種于3個10 cm2細胞培養板中，并加入含10 mg/L殺稻瘟菌素的完全培養液繼續培養(前期實驗已證實FRT細胞在含有10 mg/L殺稻瘟菌素的完全培養液中培養2周后全部死亡)，3周后挑取適宜的FRT細胞克隆并擴大培養，免疫熒光和RT-PCR實驗鑒定克隆表達TMEM16A的情況，選取純度和表達量高的FRT細胞克隆進行有限稀釋實驗3次(即計數30個FRT細胞，加入10 mL完全培養液，混勻后，各取100 μL培養液入96孔板中培養，待細胞達匯合度達70%后擴大培養，免疫熒光和RT-PCR實驗鑒定克隆表達TMEM16A的情況)，獲取表達量和純度高的TMEM16A陽性FRT細胞克隆。

3.3 免疫熒光技術鑒定TMEM16A的表達 選取瞬時轉染或穩定轉染的FRT細胞，用PBS溶液沖洗細胞3次后，用含4%多聚甲醛的PBS溶液室溫20 min后，用含0.1%Triton X-100的PBS處理10 min，加入含2%BSA的PBS封閉液室溫封閉1 h。然后加入兔抗V5多克隆抗體(1∶200)，4℃過夜。PBS溶液洗細胞4次，每次搖床5 min，以Cy3標記的羊抗兔IgGⅡ抗(1∶500)室溫孵育30 min。PBS溶液洗細胞4次，每次搖床5 min。倒置熒光顯微鏡下(Olympus BX60)觀察并拍照。

3.4 RT-PCR鑒定TMEM16A的表達 選取瞬時轉染或穩定轉染TMEM16A的FRT細胞，棄去培養液，加入TRIzol(提取6孔板中2孔細胞加入1 mL TRIzol)，按照說明書提取總RNA，以總RNA為模板，Oligo(dT)為逆轉錄的引物，在SuperScriptTMⅢ 逆轉錄酶的作用下進行逆轉錄反應。取逆轉錄產物為模板，以TMEM16A編碼區特異性引物PCR擴增目的片段。TMEM16A上游引物5′-ggacctgggctatgaggttcag-3′，下游引物 5′-cagcgcgtccccatggtactc-3′。PCR 產物經瓊脂糖電泳檢測，β-actin為內參照。β-actin上游引物 5′-catcctgcgtctggacctg-3′，下游引物 5′-atctccttctgcatcctgtc-3′。

3.5 全細胞(whole-cell)膜片鉗技術 將狀態良好的轉染TMEM16A的FRT細胞接種到玻片(Fisher)上，第2天置于倒置熒光顯微鏡下，并用電極外液灌流，電極入水后電阻約為4～6 MΩ，給予負壓形成GΩ高阻抗封接后，快速給予負壓使電極尖端的細胞膜破裂，形成whole-cell記錄模式，也可形成insideout記錄模式。如為whole-cell記錄模式，初始鉗制電壓為0 mV，記錄10 ms后，給予階梯式電壓刺激，電壓從-80 mV到+80 mV，每次增加20 mV，各記錄800 ms，800 ms后電壓變為0 mV，繼續記錄100 ms(HEKA EPC9)。電極外液(bath solution)為140 mmol/L NMDG-Cl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES。電極內液(pipette solution):0.8 mL高濃度鈣溶液和0.2 mL零濃度鈣溶液混合得到600 nmol/L Ca2+溶液即為電極內液。高濃度鈣溶液(mmol/L):146 CsCl，2 MgCl2，5 Ca-EGTA-NMDG，8 HEPES，pH 7.3(300 mOsm);零濃度鈣溶液(mmol/L):146 CsCl，2 MgCl2，5 EGTA-NMDG，8 HEPES，pH 7.3(300 mOsm)。用SF-77B快速溶液轉換設備(Warner Instruments)進行所有的灌流實驗，鈣激活氯離子通道抑制劑NFA(50 μmol/L)為對照。

3.6 鹵族元素敏感的YFP-H148Q/I152L熒光淬滅動力學實驗 將穩定轉染TMEM16A的FRT細胞接種到黑壁透明底的96孔板中，16 h后按照試劑盒說明將Lipofectamine LTX和YFP-H148Q/I152L混合物滴加入含有FRT細胞的96孔板中。36 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察YFP表達情況。以含鈣鎂離子的PBS洗滌細胞3次，最后1次留50 μL PBS，加入含2 μmol/L鈣離子載體ionomycin的高碘溶液，記錄相對熒光強度動態變化 (Fluostar多功能酶標儀，BMG)。具體設置如下:激發光波長500 nm，發射光波長540 nm。以每秒5個點的速度動態檢測相對熒光強度，其中前2 s為基線，2 s后以170 μL/s的速度向目的孔中注入120 μL含有ionomycin和高濃度碘離子的PBS緩沖液。未加ionomycin和加鈣激活氯離子通道抑制劑NFA(200 μmol/L)為對照組。

4 統計學處理

細胞膜上TMEM16A通道對碘離子轉運的活性用相對熒光強度數值與時間變化曲線反映，利用自定義的3次方程計算相對熒光強度變化的初始速度，再乘以熒光強度的變化與碘離子轉運速度的常數0.002，即為通道對碘離子的轉運速度［7］。以SPSS 15.0軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TMEM16A真核表達載體的構建

pUB6/V5-TMEM16A真核表達載體經BamH I和Xba I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示載體中位于BamH I和Xba I兩酶切位點間的原有片段被分離，載體被切割成線性，結果顯示在5 500 bp和2 900 bp處有清晰條帶，分別與載體 pUB6/V5和TMEM16A大小一致，見圖1A。挑選陽性克隆送測序，部分測序結果見圖1B，中間為TMEM16A基因C末端的Xba I酶切位點，其上游為去除終止密碼子的TMEM16A基因，下游為pUB6/V5載體序列，測序結果與GenBank數據庫獲得的TMEM16A序列比對完全一致。上述結果表明成功構建 pUB6/V5-TMEM16A真核表達載體。

Figure 1.The results of double digestion(A)and sequencing(B)of pUB6/V5-TMEM16A.1:the pUB6/V5-TMEM16A plasmid digested by BamH I and Xba I;2:DNA marker.圖1 TMEM16A真核表達載體雙酶切和測序結果

2 免疫熒光實驗結果

穩定轉染TMEM16A的FRT細胞膜上可見到明亮的鮮紅色熒光;瞬時轉染TMEM16A的部分FRT細胞膜可見到明亮的鮮紅色熒光，而未轉染或未表達的FRT細胞未見到明亮的鮮紅色熒光，見圖2。結果表明小鼠TMEM16A可在蛋白水平異源表達于FTR細胞，通過穩定轉染獲得純度和表達量高的FRT細胞克隆。

Figure 2. The protein expression of TMEM16A in FRT cells(×200).A:FRT cells stably expressed TMEM16A;B:FRT cells trasiently expressed TMEM16A.圖2FRT細胞TMEM16A蛋白的表達

3R T-PCR結果

結果顯示，在400 bp附近出現特異性條帶，與預期的目的片段大小相符，見圖3。這證實穩定轉染TMEM16A的FRT細胞在mRNA水平表達TMEM16A，獲得穩定表達TMEM16A的FRT細胞株。

4 全細胞膜片鉗的記錄結果

Figure 3.The mRNA expression of TMEM16A in the FRT cells detected by RT-PCR.1:PCR product of TMEM16A;2:DNA marker;3:PCR product of β-actin.圖3TMEM16A的RT-PCR實驗結果

應用全細胞膜片鉗技術在穩定表達TMEM16A的FRT細胞上記錄其電流特性。結果顯示，初始電壓0 mV時和600 nmol/L游離鈣離子存在時，電流為0，但隨著電壓的增加電流逐漸增大，即電流與電壓和時間呈正相關，且電流隨著時間的增加逐漸增大，見圖4A。圖4B顯示加入鈣激活氯離子通道抑制劑NFA后電流大小與圖A相比顯著下降。對A和B進行整理和分析得出I/V曲線圖(電流與電壓的關系圖)，曲線呈明顯的外向整流特性，見圖4C。沒有轉染TMEM16A的FRT細胞未記錄到電流，證明未轉染TMEM16A的FRT細胞本身并不表達TMEM16A，見圖4D。上述結果表明TMEM16A離子通道具有時間、電壓和鈣離子的依賴性以及外向整流特性，且鈣激活氯離子通道抑制劑NFA可抑制TMEM16A離子通道，證實本研究記錄的TMEM16A電流屬于經典的鈣激活氯離子電流，TMEM16A是鈣激活氯離子通道的分子基礎。

5 熒光淬滅動力學實驗結果

加入高濃度碘離子和鈣離子載體ionomycin后，相對熒光強度顯著下降，見圖5A;而僅加入高濃度的碘離子或提前加入200 μmol/L NFA的對照組相對熒光強度無明顯變化，見圖5B。Ionomycin可迅速升高胞漿中鈣離子濃度，鈣離子濃度的升高可引起TMEM16A開放，TMEM16A可具有轉運碘離子的特性，使細胞外高濃度的碘離子內流，使其敏感的YFPH148Q/I152L迅速淬滅，導致相對熒光強度迅速下降。而應用鈣激活氯離子通道抑制劑 NFA后，TMEM16A氯離子通道受到抑制，此時對碘離子通透也受到抑制，相對熒光強度無明顯變化。根據公式計算，實驗組碘離子轉運速度為0.12±0.01 d［I］/dt mM/s，對照組0.01 ±0.001 d［I］/dt mM/s，實驗組碘離子轉運速度顯著高于對照組，差異顯著(P＜0.05)。上述結果表明表達于 FRT細胞膜上的TMEM16A具有鈣激活和轉運碘離子的特性，且常用的鈣激活氯離子通道抑制劑NFA可抑制其開放。

Figure 4.Currents of TMEM16A recorded in FRT cells(n=3).A:TMEM16A currents recorded in the FRT cells stably expressing TMEM16A at a holding potential at 0 mV，and pulsing to voltages between+80 mV and-80 mV(in steps of 20 mV)by the technique of whole-cell patch clamp;B:whole-cell currents of TMEM16A recorded in the FRT cells expressing TMEM16A at a holding potential at 0 mV，and pulsing to voltages between+80 mV and-80 mV(in steps of 20 mV)in the presence of 50 μmol/L NFA;C:current-voltage relationships immediately after whole-cell access;D:whole-cell TMEM16A currents recorded in the FRT cells without TMEM16A expression.圖4 全細胞膜片鉗結果

Figure 5.TMEM16A assay based on the halide-sensitive YFP-H148Q/I152L in the FRT cells.A:representative trace showed cell fluorescence quenching upon the addition of extracellular I-plus ionomycin in the FRT cells stably expressing TMEM16A，speed:0.12 ±0.01 d［I］/dt mM/s;B:representative trace of control group，speed:0.01 ±0.001 d［I］/dt mM/s.圖5 鹵族元素敏感的YFP-H148Q/I152L檢測TMEM16A功能

討 論

哺乳動物的氯離子通道根據其門控機制分為5類:囊性纖維化跨膜傳導調節因子;電壓門控的氯離子通道;配體門控的氯離子通道;體積調控的氯離子通道和鈣激活氯離子通道［8-10］。自從上世紀80年代于非洲爪蟾卵母細胞上首次記錄到經典的鈣激活氯離子通道電流后，人們提出多個鈣激活氯離子通道的候選者，遺憾的是后續研究證實并非是真正的鈣激活氯離子通道。TMEM16A是新近發現的一種鈣激活氯離子通道，其家族共有10個成員，目前已知TMEM16A和TMEM16B為鈣激活氯離子通道，而TMEM16F為鈣激活陽離子通道。一般認為上皮細胞表達的鈣激活氯離子通道為TMEM16A，其在跨上皮液體和電解質轉運中起到重要作用;而神經元細胞表達鈣激活氯離子通道為TMEM16B，在調節動作電位產生、感覺傳導和嗅覺產生等生理活動中扮演重要角色［11］。本研究于小鼠視網膜中分離提取TMEM16A，并成功構建pUB6/V5-TMEM16A真核表達載體，并將其異源表達在FRT細胞上，倒置熒光顯微鏡可見其清晰表達于FRT細胞膜上，具有膜蛋白特性。本研究應用檢測離子通道金標準的膜片鉗實驗研究其電生理特性，結果表明記錄到的TMEM16A電流呈時間、電壓和鈣離子依賴的特性，并可被鈣激活氯離子通道抑制劑NFA抑制，具有經典的鈣激活氯離子通道電流特性，證實TMEM16A是鈣激活氯離子通道的分子基礎。

目前對TMEM16A鈣激活氯離子通道的特性已經有了一定了解，但仍有很多亟待解決的問題［12］，例如TMEM16A離子通道參與離子轉運的關鍵結構域的組成成分是什么?哪些氨基酸是TMEM16A離子轉運的關鍵氨基酸?本研究構建的TMEM16A真核表達載體是研究上述問題的關鍵工具，應用TMEM16A的表達載體可定點突變TMEM16A基因，進一步應用膜片鉗和鹵族元素敏感的YFP蛋白等檢測TMEM16A的功能，可證實TMEM16A中參與離子轉運的關鍵結構域或關鍵氨基酸。另外TMEM16A的某些生理功能和病理過程的作用仍未明了［13-16］，例如TMEM16A在血管收縮中是否扮演關鍵角色?TMEM16A與細胞的增殖、遷移、凋亡和發育中的確切作用機制如何?過表達是研究目的基因作用機制的公認方法，可將TMEM16A真核表達載體轉染至目的細胞，通過比較過表達和正常表達TMEM16A的差異，來研究TMEM16A在細胞中的具體作用。此外經過多次有限稀釋的穩定轉染細胞表達目的蛋白的量在理論上均勻一致，解決了瞬時轉染細胞因目的通道膜蛋白表達不一致造成的電流大小不同，而引起的結果分析的困難問題;本研究獲得的高表達TMEM16A的細胞株可作為研究TMEM16A在增殖、遷移和凋亡中作用的對照。此外本實驗構建的TMEM16A穩定轉染細胞模型也是研究TMEM16A的必須工具，可應用于下述關于TMEM16A的研究，例如除鈣離子外的其它二價陽離子對TMEM16A鈣激活氯離子通道的激活作用和親和力情況等相關研究。

膜片鉗是研究離子通道的“金標準”［8］，本研究不僅應用了全細胞膜片鉗技術來研究TMEM16A的電生理特性，還應用鹵族元素敏感的熒光蛋白YFPH148Q/I152L檢測TMEM16A對碘離子的轉運情況。YFP-H148Q/I152L為黃色熒光蛋白的雙突變體，具有對碘離子等鹵族元素敏感的特性，可與碘離子可逆性結合，引起碘離子速度淬滅的特點。鈣激活氯離子通道不僅可轉運體內含量最豐富的氯離子，也具有轉運碘離子等陰離子的特性，因細胞中碘離子含量甚微，可排除其它陰離子的影響。YFP-H148Q/I152L不僅可用于檢測氯離子通道的功能，還廣泛應用于氯離子通道調節劑高通量篩選研究［8-9］。本實驗應用YFP-H148Q/I152L檢測其TMEM16A轉運碘離子的功能，結果表明其可被升高細胞內鈣離子濃度的ionomycin激活，細胞外液高濃度的碘離子內流后引起YFP-H148Q/I152L相對熒光強度迅速下降，證實其具有鈣激活氯離子通道轉運碘離子的特性。在后續實驗中可應用該細胞模型進行TMEM16A鈣激活氯離子通道調節劑的篩選，目前為止缺少特異性強、親和力高的鈣激活氯離子通道調節劑是研究鈣激活氯離子通道的重要阻礙，本研究的實驗結果為高親和力和強特異性的TMEM16A調節劑的發現提供了高效的細胞模型［8，16］。

總之，本研究獲得的TMEM16A蛋白展示了經典的鈣激活氯離子通道特性。本研究構建的TMEM16A真核表達載體和穩定轉染細胞模型為后續深入研究鈣激活氯離子生理過程、病理過程中的作用以及鈣激活氯離子通道調節的發現奠定了堅實基礎。

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