白細胞介素1β和白細胞介素17在根尖周病組織肥大細胞上的表達*

施慶顏， 靳 華， 曾靖華， 鄺少華， 黃世光△

慢性根尖周病是一種以炎癥破壞為特征的疾病，炎癥性骨吸收是由根尖周組織中的免疫活性細胞或炎癥細胞分泌的各種細胞因子(cytokine，CK)介導。研究顯示IL-1β和IL-17在關節炎和牙周炎中起關鍵作用［1-2］，同時 IL-1β和IL-17也存在于根尖周病變組織中［3-4］。盡管進行了大量的實驗及臨床研究，但是參與根尖周病發生和疾病持續的免疫細胞和CK尚未闡明，參與根尖周病的IL-1β和IL-17的表達還不清楚。傳統認為肥大細胞(mast cells，MCs)是過敏性炎癥反應的主要效應細胞，除了在過敏性炎癥反應中起作用外，MCs還可通過眾多介質的表達既參與IgE依賴又參與IgE非依賴的免疫反應［5］。近年來的研究發現MCs是重要的效應和調節性免疫細胞，在固有免疫和適應性免疫反應中均有重要作用［6］。關于MCs的CK參與根尖周病尚無文獻報道。因此，本文采用免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病中MCs的分布情況并分析MCs細胞因子IL-1β及IL-17的表達情況，研究結果對于闡明MCs細胞因子IL-1β及IL-17在根尖周病發病機制中的作用具有理論意義及臨床指導價值。

材料和方法

1 研究對象

1.1 病例選擇 選擇2007年7月至2013年6月期間在暨南大學第一附屬醫院口腔醫學中心臨床診斷為根尖囊腫和根尖肉芽腫，并接受根尖刮治手術的病例。根尖肉芽腫和根尖囊腫的病例由暨南大學第一附屬醫院病理科的2名病理醫生從資料庫的100例根尖周病病例中挑出，病理診斷為根尖肉芽腫32例(年齡24～65歲，平均40.2歲)、根尖囊腫35例(年齡20～58歲，平均38.9歲)，排除急性炎癥和其它疾病。對照組35例(年齡17～24歲，平均21.5歲)為正常牙周膜，來自2013年12月期間在暨南大學醫學院附屬惠州口腔醫院牙周健康的因正畸需要拔除的前磨牙，這些前磨牙牙根發育完全并且沒有根尖及牙周病變。所有患者均沒有系統性疾病而且至少2個月前停止使用抗生素。在樣本收集之前取得患者的書面知情同意書。

1.2 實驗分組 本研究共收集樣本102例，分為(1)根尖肉芽腫組:X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區，直徑＜1 cm，邊界清楚，組織學檢查見明顯的炎癥細胞浸潤，并無鱗狀上皮襯里，共32例;(2)根尖囊腫組:X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區，直徑＞1 cm，邊界清楚有骨白線包繞，組織學檢查見根尖區組織存在部分或全部上皮覆蓋，囊腫表現為完整的囊腔，囊腔為一定厚度的復層鱗狀上皮覆蓋，囊壁存在纖維組織并有中-重度的炎癥細胞浸潤，共35例;(3)正常對照組:因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共35例。

2 方法

2.1 組織標本采集和處理 正常對照組標本取自因正畸需要拔除的前磨牙，用無菌刀片將牙周膜從牙根上刮取，樣本立即固定于4%中性甲醛緩沖溶液中48 h以上。經脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成5 μm厚度組織連續切片。根尖肉芽腫和根尖囊腫為保存石蠟塊，選取符合要求的標本進行組織連續切片。

2.2 HE染色及組織學觀察 組織切片經HE染色，光學顯微鏡下觀察各組標本的組織學改變。由2名病理醫師盲法觀察，并對根尖肉芽腫、根尖囊腫病變組織以及正常對照組健康牙周膜組織的炎癥程度進行評分，求其平均值。炎癥程度評分標準參照Huang等［7］的方法:0，無炎癥細胞浸潤;1，輕度炎癥，炎癥細胞局部呈小灶狀浸潤;2，中度炎癥，炎癥細胞呈灶狀及片狀浸潤;3，重度炎癥，炎癥細胞呈彌漫性浸潤。

2.3 IL-1β和IL-17陽性肥大細胞免疫熒光雙染色

Ⅰ抗:tryptase抗體(Abcam)，稀釋濃度為1∶200;IL-1β(Santa Cruz Biotechnology)和 IL-17抗體(Abcam)稀釋濃度為1∶100。Ⅱ抗:山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour 555?和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour 488?(Cell Signaling Technology)，稀釋濃度為1∶200。組織切片經過常規脫蠟、乙醇復水，檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復、山羊血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色后，立即在熒光顯微鏡下觀察。Tryptase免疫熒光陽性信號為綠色熒光，IL-1β和IL-17均顯示紅色熒光，定位于細胞核或細胞漿，同一視野下tryptase綠色熒光分別與IL-1β和IL-17紅色熒光重疊后為橘黃色熒光。由2名病理醫師于免疫熒光顯微鏡下觀察到MCs均表達有IL-1β和IL-17，從而對各組實驗標本中IL-1β和IL-17陽性的 MCs計數并計算各組IL-1β和IL-17陽性MCs密度(mm－2)。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。不同組間組織炎癥程度評分以及多組間每平方毫米 IL-1β和IL-17陽性MCs數目的比較均采用 Kruskal-Wallis檢驗;采用Nemenyi檢驗進行3個獨立樣本兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 組織學觀察

正常對照組未見明顯炎癥細胞浸潤(圖1A、B);根尖囊腫上皮層可見中、重度炎癥細胞浸潤:表現為細胞間水腫和以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤(圖1C、D);根尖肉芽腫表現為重度炎癥反應，可見毛細血管和成纖維細胞增生，有中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞散在浸潤;在炎癥肉芽組織周圍見纖維組織增生，肉芽組織中有泡沫細胞呈灶性分布(圖1E、F)。

Figure 1.Histology of the specimens(HE staining).A，B:healthy control group;C，D:periapical cyst group;E，F:periapical granuloma group.A，C，E:×200;B，D，F:×400.圖1 各組標本的組織學觀察

各組標本組織炎癥程度評分比較見圖2，結果顯示3組標本組織炎癥反應程度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽腫組炎癥反應程度最高(平均秩為77.00)。Nemenyi檢驗結果顯示:正常對照組與根尖囊腫組組織炎癥程度之間存在顯著差異(P＜0.01);正常對照組與根尖肉芽腫組組織炎癥程度之間有顯著差異(P＜0.01);根尖囊腫組與根尖肉芽腫組組織炎癥程度無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.Inflammation score in the specimen.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.圖2 各組標本組織的炎癥程度評分

2 IL-1β陽性MCs免疫熒光雙染色結果

各組標本組織中IL-1β陽性MCs免疫熒光雙染色結果見圖3。結果顯示，各組標本組織MCs均表達IL-1β。正常對照組:牙周膜組織中只見少量散在分布的IL-1β陽性MCs(圖3A、B、C);根尖囊腫組:組織中IL-1β陽性MCs數目顯著增多，且MCs有脫顆粒現象(圖3D、E、F);根尖肉芽腫組:組織中出現大量的IL-1β陽性MCs，且MCs伴明顯脫顆粒現象(圖3G、H、I)。

Figure 3.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-IL-1β immunofluorescence double staining(×1 000).A～C:healthy control group;D～F:periapical cyst group;G～I:periapical granuloma group.A，D，G:tryptase;B，E，H:IL-1β;C，F，I:merged.圖3 各組標本組織中的IL-1β陽性MCs

各組標本組織中IL-1β陽性MCs密度見圖4，結果顯示3組標本 IL-1β陽性 MCs密度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽腫組IL-1β陽性MCs密度最高(平均秩為75.09)。Nemenyi檢驗結果顯示:正常對照組與根尖囊腫組IL-1β陽性MCs密度之間存在顯著差異(P＜0.01);正常對照組與根尖肉芽腫組IL-1β陽性MCs密度之間有顯著差異(P＜0.01);根尖囊腫組與根尖肉芽腫組IL-1β陽性MCs密度無顯著差異(P ＞0.05)。

Figure 4.The density of IL-1β positive MCs.M A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.圖4 各組標本組織中IL-1β陽性的MCs密度

3 IL-17陽性MCs免疫熒光雙染色結果

各組標本組織中IL-17陽性肥大細胞免疫熒光雙染色結果見圖5。結果顯示，各組標本組織MCs均表達IL-17。在正常對照組，牙周膜組織中只見少量散在分布的IL-17陽性MCs(圖5A、B、C);根尖囊腫組:組織中IL-17陽性MCs數目顯著增多，且MCs有脫顆?，F象(圖5D、E、F);在根尖肉芽腫組，組織中出現大量的IL-17陽性MCs，且MCs伴明顯脫顆?，F象(圖5G、H、I)。

各組IL-17陽性MCs密度見圖6，結果顯示3組標本IL-17陽性MCs密度不同(P＜0.01)，其中根尖肉芽腫組 IL-17陽性 MCs密度最高(平均秩為76.92)。Nemenyi檢驗結果顯示:正常對照組與根尖囊腫組IL-17陽性MCs密度之間存在顯著差異(P＜0.01);正常對照組與根尖肉芽腫組IL-17陽性MCs密度之間有顯著差異(P＜0.01);根尖囊腫組與根尖肉芽腫組IL-17陽性MCs密度無顯著差異(P＞0.05)。

4 IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度相關性分析

Figure 5.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-IL-17 immunofluorescence double staining(×1 000).A～C:healthy control group;D～F:periapical cyst group;G～I:periapical granuloma group.A，D，G:tryptase;B，E，H:IL-17;G，F，I:merged.圖5 各組標本組織中的IL-17陽性MCs

Figure 6.The density of IL-17 positive MCs.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs A.圖6 各組標本組織中IL-17陽性的MCs密度

各組IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關系見圖7。結果顯示，與正常對照組相比，慢性根尖周炎組織炎癥程度顯著增加(P＜0.01)。同時，隨著根尖周組織炎癥程度的增加，IL-1β陽性MCs密度也隨之增加。經Pearson相關分析及直線回歸分析，3組標本組織中IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度密切相關，且存在正的直線相關關系(P＜0.01)。

5 IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度相關性分析

各組IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關系見圖8。結果顯示，與正常對照組相比，慢性根尖周炎組織炎癥程度顯著增加(P＜0.01)。同時，隨著根尖周組織炎癥程度的增加，IL-17陽性MCs密度也隨之增加。經Pearson相關分析，3組標本組織中IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度密切相關，且存在正的直線相關關系(P＜0.01)。

Figure 7.Correlation analysis between density of IL-1β positive MCs and inflammation score.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).圖7 各組標本IL-1β陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關系

Figure 8.Correlation analysis between density of IL-17 positive MCs and inflammation score.A:healthy control group(n=35);B:periapical cyst group(n=35);C:periapical granuloma group(n=32).圖8 各組標本IL-17陽性MCs密度與組織炎癥程度之間的關系

討 論

研究表明來源于感染根管的微生物是根尖周疾病的主要病因，根尖周疾病通常伴有根尖周的骨吸收，目前關于根尖周感染致骨吸收的致病機制尚未闡明。體外骨吸收實驗結果顯示，IL-1β是最活躍的骨吸收因子［8］。有報道指出 IL-1β、IL-1α 和 TNF-α在體內也能刺激骨吸收［9-10］，這些介質在體外也能發揮相似的作用，表明它們在骨吸收性疾病的致病機制中具有潛在的作用。IL-17是一種促炎介質，研究顯示IL-17在骨破壞性疾病中顯著升高，如類風濕性關節炎和牙周炎［1］，同時 IL-17也存在于根尖周病中［3-4］，表明Th17細胞也可能促進組織破壞，包括根尖周骨破壞。目前，IL-17在根尖周病中的具體作用機制還不清楚［11］。

傳統認為MCs是過敏性炎癥反應的主要效應細胞，除了在過敏性炎癥反應中起作用外，MCs還可通過眾多介質的表達既參與IgE依賴又參與IgE非依賴的免疫反應［12］。近年來的研究發現MCs是重要的效應和調節性免疫細胞，對固有免疫和適應性免疫均有重要作用［13］。MCs在根尖周疾病中的作用，目前尚無統一的看法。MCs在根尖肉芽腫和囊腫中均有發現，并且囊腫中MCs比肉芽腫多［14］。de Noronha Santos Netto等［15］在根尖囊腫的炎癥病變區觀察到肥大細胞數量增多，而且在病變的深層組織中出現明顯的脫顆粒MCs，提示MCs與牙源性病變的炎癥反應和囊性病變有關。等［16］觀察到囊腫MCs數量比肉芽腫多，且MCs主要出現在根尖周病變的炎性浸潤和成纖維細胞區域。Ledesma-Montes等［17］觀察到在有上皮增生的肉芽腫中MCs增多較多，膿腫部位MCs數量較少，提示MCs與根尖周炎癥進程的發生、發展和持續存在密切關系。我們的研究結果顯示，根尖肉芽腫和囊腫MCs數量較正常對照明顯增多，但MCs數量在肉芽腫和囊腫無明顯差異。

根尖周病中活化的MCs既可以分泌IL-1又可以分泌IL-17，盡管IL-1不是作為CTMC中一種預先合成的介質存在［18-19］。MCs的活化以及隨之而來的脫顆粒，存在于細胞外環境中的Tryptase能激活MCs釋放 IL-1β［20］。IL-1、IL-17 作為一種促炎介質，可引起根尖周組織的炎癥反應及破骨細胞生成和骨吸收。

本實驗我們采用免疫熒光雙染色法首次證實了人類慢性根尖周病組織中的肥大細胞表達IL-1β和IL-17。我們的研究結果顯示，慢性根尖周病組織中IL-1β和IL-17陽性MCs數目顯著高于正常對照組;同時，隨著根尖周組織炎癥程度的增加，IL-1β和IL-17陽性MCs密度也隨之增加;提示IL-1β和IL-17陽性MCs可能在慢性根尖周炎的致病機制中發揮重要作用。因此，控制MCs IL-1β和IL-17的合成或者調節MCs的功能可能成為阻止根尖周病發展的一個治療目標，從而為根尖周病的治療提供新的靶點。

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