蝙蝠蛾擬青霉菌絲體抗小鼠力竭疲勞作用

許宇輝，梁慧春，楊 征

(軍事醫學科學院基礎醫學研究所認知與心理衛生研究中心，北京 100850)

疲勞是一種普遍的生理現象，主要包括精神疲勞和軀體疲勞兩種，在我國因過度疲勞致病甚至死亡的人數逐年增加，全球調查顯示，35%以上的人群處于疲勞狀態［1］。疲勞不僅伴隨著各種疾病的發生如艾滋病、肝炎及腫瘤等［2－3］，而且也會導致機體免疫力下降，內分泌失調，從而引起多種疾病，如感染、糖尿病等［1，4］。自 1880 年 Mosso 開始研究人類疲勞至今，大量研究者對疲勞進行了探討，并對疲勞發生的機制提出了各種假說，如能量耗竭學說，代謝產物累積學說以及中樞遞質失衡學說等［5］。在疲勞的研究中，我國具有豐富的中藥資源與基礎，很多中藥已被廣泛用于改善疲勞，并顯示出優越的抗疲勞作用［6］。

蟲草是我國稀有的傳統藥材，目前已發現的蟲草種類至少有400多種［7］，而其中的冬蟲夏草〔Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc〕特指產于青海、西藏及云南地區的蟲草，其蟲體為蝙蝠蛾科的蟲草蝙蝠蛾幼蟲。研究發現，冬蟲夏草具有抗腫瘤、抗衰老、耐缺氧和調節機體免疫功能等多種藥理學活性［8－9］。在抗疲勞領域的研究中，大量的研究結果也顯示了冬蟲夏草及其提取物具有改善人體運動耐力，緩解機體疲勞，延長嚙齒類動物強迫游泳時間等多種抗疲勞作用［10－13］。

然而，由于野生冬蟲夏草通常只能生長在3500～5000 m的青藏等地區，且必須寄生于蝙蝠蛾科的蟲草蝙蝠蛾幼蟲中才能生存，人們對其藥用價值的研究與運用也受到了限制，近年來由于野生冬蟲夏草資源的過度開采，使其成為瀕危物種［14］。為解決這些問題，越來越多的研究者開始致力于冬蟲夏草及其人工替代品的研發。1982年，中國中醫研究院中藥研究所在云南迪慶藏族自治州采集到新鮮冬蟲夏草，并從中分離出10多種真菌菌株，其蟲體經鑒定并確認為蝙蝠蛾科的蟲草蝙蝠蛾。1989年，戴如琴等［15］對其中的4個菌株進行了培養和形態學觀察，并將其命名為蝙蝠蛾擬青霉［15］。隨著發酵培育技術的發展與運用，冬蟲夏草中提取的蝙蝠蛾擬青霉菌株可通過人工發酵培育的方式進行大規模的無性繁殖與生產。由此獲得的蝙蝠蛾擬青霉菌絲體(Paecilomyces hepiali mycelium，PHM)已被成功開發為滋補、保健的功能性食品或藥物，如國內已上市的“金水寶膠囊”和國外已上市的“Cordy-MaxTM”。大量的研究表明，人工發酵培育的PHM具有與野生冬蟲夏草相似的成分及藥理學活性［16－19］。本研究的目的是采用輪式疲勞儀建立小鼠力竭疲勞模型，并通過檢測疲勞相關的能源物質與代謝產物來評價人工培育的PHM對小鼠力竭疲勞的作用，并探討其潛在的作用機制。

莫達非尼是一種中樞興奮性藥物，于1994年在法國上市，主要用于抗疲勞，調節睡眠，改善認知以及維持高危操作人員清醒狀態［20－22］。研究發現，該藥能夠激動腦內 α1腎上腺素受體［23－24］，并抑制多巴胺轉運體，增加大腦皮質和尾狀核多巴胺濃度［25－27］，其抗疲勞作用與調節中樞的興奮性神經遞質水平有關。本研究選用莫達非尼作為陽性對照藥物，以檢測實驗中所建立的力竭疲勞模型，并對比評價PHM的抗力竭疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

人工發酵培育的PHM干燥粉末(蘭州科林生物醫藥有限公司，腺苷含量為0.74 mg·g－1)溶于滅菌注射用水中，配制成濃度為14，28和56 g·L－1的混懸溶液供小鼠ig給藥。莫達非尼(山東齊魯制藥，生產批號:110619-1，純度99.57%)溶于1%的CMC-Na 中，配制成濃度為 1.3 g·L－1的混懸溶液供小鼠 ig給藥用。給藥體積均為每 0.1 mL(10 g)。科研用試劑盒，包括糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒、乳酸試劑盒以及血清肌酸激酶試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

YLS-10B型8通道小鼠輪式疲勞儀(濟南益延科技發展有限公司，中國)，每個輪式跑道的寬為5 cm，直徑為20 cm。UV-1200型紫外分光光度儀(上海美譜達儀器有限公司，中國)。D2012小型高速離心機(Scilogex，美國)。

1.2 動物、模型制備［24］與分組

72只雄性昆明小鼠，體質量為18～22 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK-(軍)2012-0004。動物飼養環境溫度為20～22℃，濕度為50% ～60%。動物自由攝食、飲水，并保持12 h的黑暗交替。飼養2 d后，隨機分為6組，每組12只，分別為正常對照組，模型組，莫達非尼13 mg·kg－1組，PHM 140，280 和560 mg·kg－1組。除正常對照組外，其余小鼠采用輪式疲勞儀使小鼠接受每日30 min且連續18 d的強迫攀跑訓練，第1 天(d 1)攀跑速度為 10.2 m·min－1，并在隨后的d 5，d 9，d 13和d 17分別將速度增加至10.8，11.4，12.0 和12.6 m·min－1;d 19 小鼠進行速度為12.6 m·min－1，時間為60 min的力竭訓練。除正常對照組小鼠僅給予溶媒而不參與攀跑訓練外，其他所有小鼠均于給藥后40 min進行強迫攀跑訓練。

1.3 電擊次數及體質量的測定

1.2項處理的各組小鼠，分別于d5，d9，d13，d17和d19記錄小鼠在訓練中所受的電擊次數，并記錄小鼠每天的體質量。

1.4 組織樣本的準備與生化指標的檢測

在d19力竭訓練結束后，將小鼠置于安靜環境中休息40 min，休息過程中自由攝食、飲水。休息結束后，通過眼眶取血，并立即經頸椎脫斷處死小鼠，在冰板上迅速取出動物的肝和后肢肌肉組織，用冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后凍存于－20℃冰箱內。血液樣品于45°斜面靜置30 min后，以4000×g離心 15 min，取上清液，凍存于－20℃冰箱內。按照試劑盒要求檢測以上組織樣品中肌糖原，肝糖原，血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶的含量。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 PHM對力竭小鼠體質量的影響

表1結果顯示，未參與攀跑訓練的正常對照組小鼠的體質量略高于其他組動物，但無統計學差異。給予PHM和莫達非尼組的體質量與模型組相比，也無統計學差異，說明PHM和莫達非尼對小鼠的體質量無影響。

2.2 PHM對力竭小鼠電擊次數的影響

表2結果顯示，與模型組相比，莫達非尼組小鼠在首次給藥后便能明顯降低小鼠的電擊次數，且d9，d13和d17所記錄的電擊次數仍顯著低于模型組(P ＜0.01)。PHM 280和560 mg·kg－1組在連續給藥17 d后，其電擊次數才開始顯著低于模型組(P＜0.01)。在d19的力竭訓練中，莫達非尼組和PHM 280和560 mg·kg－1組的電擊次數顯著下降(P ＜0.01)。此外，PHM 140 mg·kg－1雖然在一定程度上減少了小鼠的電擊次數，但與模型組相比并無顯著性差異。

Tab.1 Effect of Paecilomyces hepiali mycelium(PHM)on body mass of exhausted mice

2.3 PHM對小鼠肌糖原、肝糖原、血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶水平的影響

表3結果顯示，與未參與攀跑訓練的正常對照組相比，模型組小鼠的肌糖原和肝糖原水平顯著降低(P＜0.01)，而血清尿素氮和血清肌酸激酶水平則顯著升高(P＜0.05)，說明小鼠在接受長期高強度的運動訓練后，其體內能源供給不足，代謝產物累積過度。然而，這種致疲勞的改變可以通過連續使用PHM而得到改善或恢復，尤其是PHM 560 mg·kg－1不僅能有效升高由高強度運動所致低水平的肌糖原和肝糖原(P＜0.01)，還能顯著降低由高強度運動所致高水平的血清尿素氮，血清乳酸和血清肌酸激酶(P＜0.05)。陽性對照藥物為莫達非尼對于長期高強度運動所致的疲勞相關能源物質含量的下降及代謝產物的累積并無明顯的改善作用。

Tab.2 Effect of PHM on number of electric shocks of exhausted mice

Tab.3 Effect of PHM on fatigue-related biochemical parameters of exhausted mice

3 討論

本研究結果顯示，PHM連續給藥17 d后能夠顯著降低小鼠的電擊次數，并能顯著增加小鼠體內肌糖原和肝糖原水平，降低致疲勞代謝產物血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶的水平。PHM抗疲勞機制與莫達非尼并不相同，PHM可能通過增加機體糖原的儲備，增強有氧代謝，并減少運動后體內致疲勞代謝產物的積累而起到抗疲勞的作用。

一直以來，許多研究中均采用強迫游泳模型來進行力竭疲勞實驗，但存在易致動物嗆水，造成動物恐懼等缺點。目前，一些研究也開始關注并利用嚙齒類動物善于攀跑的特性，通過采用輪式疲勞儀來強迫動物接受長期的攀跑訓練，以此來模擬動物的力竭疲勞［28－29］。與強迫游泳模型相比，輪式疲勞儀能夠避免人為計時誤差、動物嗆水、恐懼等因素對實驗造成的干擾，同時實驗人員可以根據實驗情況來調整和設置動物攀跑訓練的各種條件和參數，如運動速度、運動強度以及運動時間等。在訓練過程中，儀器通過電擊來強迫小鼠進行力竭運動并自動記錄動物的被電擊次數，從而更客觀地反映動物的運動耐力與疲勞的發展。

本研究發現，陽性對照藥莫達非尼在首次給藥后便能顯著減少動物的電擊次數，增強動物的運動耐力，但其對高強度運動所致體內肌糖原，肝糖原，血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶改變并無影響，該結果與文獻報道相似［24，30］。許多研究顯示，莫達非尼能夠激動腦內 α1腎上腺素受體［23－24］，抑制多巴胺轉運體，增加大腦皮質和尾狀核多巴胺濃度［25－27］的作用，并能增加動物的自發活動。因此，其抗疲勞作用可能與調節中樞興奮性神經遞質水平有關。PHM首次給藥并不能馬上起效，但其在連續給藥17 d后開始顯示出抗疲勞作用，在顯著降低小鼠電擊次數的同時，還能顯著增加小鼠體內肌糖原和肝糖原含量，并降低血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶水平。此外，文獻報道顯示，PHM 具有鎮靜、催眠作用［31］，由此說明，PHM抗力竭疲勞的機制與莫達非尼不同，與調節中樞興奮性神經遞質水平無關。

目前對于運動性疲勞的形成機制有多種理論學說，如“能源耗竭理論”，“代謝產物累積理論”及“內環境穩定性失衡理論”等［5，32］。這些理論學說認為，疲勞是由機體運動后能源物質儲備下降，致疲勞的代謝產物累積以及由此引發的細胞內環境失衡等多種因素引起［5，32－33］。研究表明，運動所致的體能耗竭總是與糖原的耗竭同時發生。當機體進行高強度運動時，肌糖原可迅速被動用，從而為肌肉的收縮提供能量，隨著運動時間的延長和運動強度的增加，肌糖原逐漸耗竭。此時，為維持正常的血糖水平，機體開始動用肝糖原，進而導致肝糖原減少［34］。糖原的耗竭將會嚴重影響機體的運動能力，尤其是運動耐力。因此，體內肌糖原和肝糖原的含量是反映軀體運動耐力和疲勞發生快慢或程度的敏感指標［35－37］。通常情況下，糖原等物質的有氧代謝是機體的主要供能方式，1 mol葡萄糖可凈生成32或34 mol ATP。但是在長時間、高強度的運動中，機體處于相對缺氧的狀態，由于有氧代謝的速度較慢，無法及時滿足能量需要，因此機體通過無氧糖酵解方式迅速生成ATP供能。然而，1 mol葡萄糖經糖酵解方式只能凈生成2 mol ATP，其供能效率遠遠低于有氧代謝，不僅增加了糖原消耗的速度和程度，同時還導致機體生成大量的乳酸。研究表明，乳酸作為無氧糖酵解的產物會引起骨骼肌細胞內H+和無機磷(Pi)的堆積，從而抑制橫橋活性和肌漿網中Ca2+釋放，并降低肌纖維對Ca2+的敏感性，最終使肌細胞收縮功能下降而出現疲勞［38－41］。因此，乳酸水平也是反映機體有氧代謝能力和疲勞程度的重要指標。此外當糖原代謝所提供的能量無法滿足機體運動所需的能量時，機體會動員脂肪的分解，甚至蛋白質的分解來提供能量，從而使蛋白代謝產物血清尿素氮的含量升高，因而通過檢測機體血清尿素氮的含量也可以反映出機體的運動供能和代謝情況，從而間接提示機體的運動耐力與疲勞程度［42］。當機體功能不足時，體內血清肌酸肌酶能夠代償性的增加，從而促進磷酸基團轉換為肌酸，并進一步促使肌酸轉變為高能磷酸肌酸分子，以作為細胞快速獲取能量的來源。但是，血清肌酸肌酶含量的增加會對肌肉造成物理或化學形式的損傷，從而降低機體的運動耐力，加重機體的疲勞狀況［43－44］。因此，體內血清肌酸激酶含量的升高可以反映出機體供能不足和運動能力下降。

綜上，PHM可能通過增加能源物質的儲備，增強機體有氧代謝能力，并減少機體致疲勞代謝產物的積累，以維持機體內環境穩定及正常代謝功能，從而起到抗力竭疲勞的作用。PHM作為冬蟲夏草替代品用于緩解疲勞可能具有一定的潛力和良好的前景。

［1］He JL.Review on the evaluateion standard of body fatigue［J］.Tibetan Med J(西藏醫藥雜志)，2013，34(2):29-32.

［2］Posadzki P，Moon TW，Choi TY，Park TY，Lee MS，Ernst E.Acupuncture for cancer-related fatigue:a systematic review of randomized clinical trials［J］.Support Care Cancer，2013，21(7):2067-2073.

［3］Tavakkoli M，Ferrando SJ，Rabkin J，Marks K，Talal AH.Depression and fatigue in chronic hepatitis C patients with and without HIV co-infection［J］.Psychosomatics，2013，54(5):466-471.

［4］Li X，Huang WX，Lu JM，Yang G，Ma FL，Lan YT，et al.Study of the neuroendocrine and immunologic mechanism of fatigue caused by military operations［J］.Med J Chin PLA(解放軍醫學雜志)，2012，37(1):62-65.

［5］Yu G.Review on the research of sports fatigue mechanism［J］.Sci Technol Inf(科技信息)，2013，(19):272-273.

［6］Zheng W，Yang HB.Review of progress made in researches on kinetic fatigue resistance by using traditional Chinese medicines［J］.J Phys Educ(體育學刊)，2010，17(6):107-112.

［7］Paterson RR. Cordyceps:a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?［J］.Phytochemistry，2008，69(7):1469-1495.

［8］Ng TB， Wang HX. Pharmacologicalactions of Cordyceps，a prized folk medicine［J］.J Pharm Pharmacol，2005，57(12):1509-1519.

［9］Yue K，Ye M，Zhou Z，Sun W，Lin X.The genus Cordyceps:a chemical and pharmacological review［J］.J Pharm Pharmacol，2013，65(4):474-493.

［10］Koh JH，Kim KM，Kim JM，Song JC，Suh HJ.Antifatigue and antistress effect of the hot-water fraction from mycelia of Cordyceps sinensis［J］.Biol Pharm Bull，2003，26(5):691-694.

［11］Nagata A， Tajima T， Uchida M. Supplemental anti-fatigue effect of Cordyceps sinensis(tochukaso)extract powder during three stepwise exercise of human［J］.Jpn J Phys Fitness Sports Med，2006，5(Suppl):S145-S152.

［12］Li T， Li W. Impactof polysaccharides from Cordyceps on antifatigue in mice［J］.Scic Res Essay，2009，4(7):705-709.

［13］Kumar R， Negi PS， Singh B， Ilavazhagan G，Bhargava K，Sethy NK.Cordyceps sinensis promotes exercise endurance capacity of rats by activating skeletal muscle metabolic regulators［J］.J Ethnopharmacol，2011，136(1):260-266.

［14］Leung PH，Zhang QX，Wu JY.Mycelium cultivation，chemical composition and antitumour activity of a Tolypocladium sp.fungus isolated from wild Cordyceps sinensis［J］.J Appl Microbiol，2006，101(2):275-283.

［15］Dai RQ，Lan JL，Chen QT，Chen WH，Li XM，Shen CY.Research on Paecilomyces hepiali Chen et Dai，sp.nov.［J］.Acta Agr Univ Pekinensis(北京農業大學學報)，1989，15(2):221-224.

［16］Wang F，Zhu PX，Liang YX，Zhao SM，Yan NF.Effects of polysaccharides of the mycelium of Cordyceps sinensis on ability of anti-fatigue and anti-anoxia in mice［J］.Food Sci Technol(食品科技)，2012，37(10):164-167.

［17］Wei L，Zhao YH，Guo S.The content of active components of Cordyceps sinensis［J］.West China J Pharm Sci(華西藥學雜志)，2003，18(5):359-360.

［18］Xiang M，Tang J，Zou XL，Zhao ZY，Wang YY，Xie SN.Beta cell protecting and immunomodulatory activities of Paecilomyces Hepiali Chen mycelium in STZ induced T1DM mice［J］.Am J Chin Med，2009，37(2):361-372.

［19］Yu HF.Optimization of parameters affecting the enzymatic extraction of mannitol and adenosine from Paecilomyces hepiali mycelium［J］.Acta Edulis Fungi(食用菌學報)，2010，17(4):44-47.

［20］Turner DC， Clark L， Dowson J， Robbins TW，Sahakian BJ.Modafinil improves cognition and response inhibition in adult attention-deficit/hyperactivity disorder［J］.Biol Psychiatry，2004，55(10):1031-1040.

［21］Ballon JS， Feifel D. A systematic review of modafinil:Potential clinical uses and mechanisms of action［J］.J Clin Psychiatry，2006，67(4):554-566.

［22］Wisor JP，Dement WC，Aimone L，Williams M，Bozyczko-Coyne D.Armodafinil，the R-enantiomer of modafinil:wake-promoting effects and pharmacokinetic profile in the rat［J］.Pharmacol Biochem Behav，2006，85(3):492-499.

［23］Siegel JM.REM sleep［M］∥Kryger MK，Toth T，Dement WC，eds.Principles and Practice of Sleep Medicine.4th ed.New York:Saunders.2005:120-135.

［24］Cao Y，Hu Y，Liu P，Zhao HX，Zhou XJ，Wei YM.Effects of a Chinese traditional formula Kai Xin San(KXS)on chronic fatigue syndrome mice induced by forced wheel running［J］.J Ethnopharmacol，2012，139(1):19-25.

［25］Mignot E，Nishino S，Guilleminault C，Dement WC.Modafinil binds to the dopamine uptake carrier site with low affinity［J］.Sleep，1994，17(5):436-437.

［26］de Saint Hilaire Z，Python A，Blanc G，Charnay Y，Gaillard JM.Effects of WIN 35，428 a potent antagonist of dopamine transporter on sleep and locomotor activity in rats［J］.Neuroreport，1995，6(16):2182-2186.

［27］Wisor JP，Nishino S，Sora I，Uhl GH，Mignot E，Edgar DM.Dopaminergic role in stimulant-induced wakefulness［J］.J Neurosci，2001，21(5):1787-1794.

［28］Ottenweller JE，Natelson BH，Gause WC，Carroll KK，Beldowicz D，Zhou XD，et al.Mouse running activity is lowered by Brucella abortus treatment:a potential model to study chronic fatigue［J］.Physiol Behav，1998，63(5):795-801.

［29］Ferreira A，Lamarque S，Boyer P，Perez-Diaz F，Jouvent R，Cohen-Salmon C.Spontaneous appetence for wheel-running:a model of dependency on physical activity in rat［J］.Eur Psychiatry，2006，21(8):580-588.

［30］Hu Y，Cao Y，Liu M，Liu P，Cui H，Guo DH.Behavioral and biochemical effects of a formulation of the traditional Chinese medicine，Kai-Xin-San，in fatigued rats［J］.Exp Ther Med，2013，6(4):973-976.

［31］Ding T，Shao Y，Fan MZ.Isolation and identification of sedative and hypnotic compound from the fermentation broth of Hirsutella sinensis［J］.Mycosystema(菌物學報)，2008，27(6):956-963.

［32］Huang CC，Hsu MC，Huang WC，Yang HR，Hou CC.Triterpenoid-rich extract from Antrodia camphorata improves physical fatigue and exercise performance in mice［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012:364741.

［33］You LJ，Zhao MM，Regenstein JM，Ren JY.In vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of loach(Misgurnus anguillicaudatus)peptides prepared by papain digestion［J］.Food Chem，2011，124(1):188-194.

［34］Qu S.Glucose metabolism［M］∥Cha XL，Zhou CY.Biochemistry(生物化學).7th ed.Beijing:People's Medical Publishing House，2010:105-108.

［35］Wang L，Zhang HL，Lu R，Zhou YJ，Ma R，Lv JQ，et al.The decapeptide CMS001 enhances swimming endurance in mice［J］.Peptides，2008，29(7):1176-1182.

［36］Jin HM，Wei P.Anti-fatigue properties of tartary buckwheat extracts in mice［J］.Int J Mol Sci，2011，12(8):4770-4780.

［37］Hang YJ，Du WH.Domestic and foreign research progress on anti-fatigue［J］.Pract Prev Med(實用預防醫學)，2012，19(7):1112-1116.

［38］Brooks GA.Ctate doesn't necessarily cause fatigue:why are we surprised?［J］.J Physiol，2001，536(Pt 1):1.

［39］Phillips SK，Wiseman RW，Woledge RC，Kushmerick MJ.The effect of metabolic fuel on force production and resting inorganic phosphate levels in mouse skeletal muscle［J］.J Physiol，1993，462:135-146.

［40］Mainwood GW，Renaud JM.The effect of acidbase balance on fatigue of skeletal muscle［J］.Can J Physiol Pharmacol，1985，63(5):403-416.

［41］Mainwood GW，Worsley-Brown P.The effects of extracellular pH and buffer concentration on the efflux of lactate from frog sartorius muscle［J］.J Physiol，1975，250(1):1-22.

［42］Shang H，Cao S，Wang J，Zheng H，Putheti R.Glabridin from Chinese herb licorice inhibits fatigue in mice［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2009，7(1):17-23.

［43］Coombes JS，McNaughton LR.Effects of branchedchain amino acid supplementation on serum creatine kinase and lactate dehydrogenase after prolonged exercise［J］.J Sports Med Phys Fitness，2000，40(3):240-246.

［44］Warren GL，Ingalls CP，Lowe DA，Armstrong RB.Excitation-contraction uncoupling:major role in contraction-induced muscle injury［J］.Exerc Sport Sci Rev，2001，29(2):82-87.