雷公藤多苷對糖尿病腎病大鼠的抗氧化應激作用

張玉霞，劉國玲，王家勤，李宜川，胡靈衛，蘆 琨

(1.新鄉醫學院，河南新鄉 453003;2.商丘醫學高等專科學校，河南商丘 476100;3.新鄉醫學院第三附屬醫院，河南新鄉 453003)

糖尿病性腎病(diabetic nephropathy，DN)的發病機制十分復雜，但近年來研究發現，氧化應激在DN的發生和發展中發揮非常重要的作用。雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii polyglycoside，TWP)是從雷公藤植物中提取的總苷，其主要成分為環氧二萜內酯類化合物。研究報道，TWP具有抑制細胞和體液免疫功能的作用，從多個環節抑制免疫應答過程［1］。本研究通過觀察TWP對DN大鼠血清過氧化氫酶(catalase，CAT)活性和超氧陰離子()含量及腎組織谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影響，探討TWP對DN大鼠腎的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和主要儀器

Sprague-Dawley(SD)大鼠85只，雄性，體質量160～180 g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，許可證號:SCXK(鄂)2011-0007。TWP購于上海融合有限公司，純度98.7%;鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)由美國Sigma公司提供，臨用前用枸櫞酸緩沖液 0.1 mol·L－1溶解(pH 4.2);血糖、肌酐清除率(creatinine clearance rate，Clcr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、24 h尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)試劑盒均購于中生北控生物科技股份有限公司;GSHPx，MDA，和CAT試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。Accu-Chek型血糖儀及血糖試紙(德國羅氏公司)，7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)，500型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 糖尿病性腎病模型的制備和給藥

85只大鼠按體質量隨機分為正常對照組(13只)和DN模型組(72只)。模型組單次ip給予STZ 52 mg·kg－1，正常對照組 ip給予等體積0.1 mol·L－1枸櫞酸緩沖液。注射 STZ 72 h 后，尾靜脈采血測空腹血糖并同時測尿糖，空腹血糖≥16.7 mmol·L－1、尿糖(++)以上為糖尿病模型制備成功。參照文獻［2］，DM造模成功后繼續喂養3周，以 3 周后空腹血糖≥16.7 mmol·L－1，尿糖+++以上、尿量大于造模前50%且24 h尿白蛋白大于造模前的50%為DN模型制備成功。將56只DN造模成功的大鼠隨機分為DN模型對照組及 TWP 4.5，9.0 和18.0 mg·kg－1組，每組14 只。TWP組ip給予TWP混懸液，正常對照組和DN模型對照組ip給予等體積飲用水，每天上午給藥1次，連續8周。實驗期間大鼠自由飲水，正常飲食，不給予胰島素及其他降糖藥物。

1.3 生化指標測定

用藥8周末稱大鼠體質量，ip給予10%水合氯醛300 mg·kg－1麻醉，打開腹腔，心臟取血，離心留取血清，－20℃保存。采用血糖儀測定血糖;全自動生化分析儀檢測血BUN，Scr和Ucr水平，應用公式計算，Clcr=(Ucr×每分鐘尿量)/Scr。實驗結束前2 d將大鼠置代謝籠，收集24 h尿液，離心，取上清，用ELISA試劑盒檢測24 h UAER。

1.4 腎組織GSH-Px活性和 MDA含量及血清CAT活性和含量的測定

用藥8周末，取左腎凍存。測定前取凍存的腎組織，用冷生理鹽水制成10%的勻漿，硫代巴比妥酸縮合法檢測MDA含量，比色法測定GSH-Px活性。取保存的血清，可見光方法檢測過CAT活性，比色法測定水平。以上各指標都按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 腎組織病理變化觀察

用藥8周末，取右腎，腎組織切成8 mm3小塊，甲醛固定，切片，HE染色觀察組織病理改變。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 TWP對 DN大鼠血糖、Clcr、BUN和 24 h UAER的影響

由表1可見，與正常對照組相比，模型對照組空腹血糖、BUN和 UAER均顯著增高(P＜0.01)，Clcr明顯降低(P＜0.01);與模型對照組相比，TWP 3個劑量組血糖無明顯改變，BUN和UAER均顯著降低(P ＜0.01)，Clcr明顯升高(P ＜0.01)。

Tab.1 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside(TWP)on glucose，creatinine clearance rate(Clcr)，blood urea nitrogen(BUN)and 24 h urine albumin excretion rate(24 h UAER)of diabetic nephropathy(DN)model rats

Tab.2Effect of TWP on catalase(CAT)activity and superoxide anion()content in serum and glutathione peroxidase(GSH-Px)activity and malondialdehyde(MDA)content in renal tissue of DN rats

Tab.2Effect of TWP on catalase(CAT)activity and superoxide anion()content in serum and glutathione peroxidase(GSH-Px)activity and malondialdehyde(MDA)content in renal tissue of DN rats

See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=13 －14.＊＊P ＜0.01，compared with normal control group;##P ＜0.01，compared with model control group.

GroupCAT/U·L－1O÷2/kU·L－1MDA/mmol·g－1GSH-Px/kU·g －1 Normal control 602 ±153 71 ±15 2.51 ±0.15 59 ±6 Model 232 ±100＊＊ 125 ±12＊＊ 3.64 ±0.18＊＊ 40 ±4＊＊Model+TWP 4.5 301 ±82 108 ±18 3.32 ±0.21 44 ±3 9.0 399 ±79## 94 ±20## 3.15 ±0.05## 50 ±6##18 487 ±127## 86 ±18## 3.01 ±0.09## 52 ±5##

2.2 TWP對DN大鼠血清CAT活性和含量及腎組織GSH-Px活性和MDA含量的影響

由表2可見，與正常對照組相比，模型對照組血清CAT活性和腎組織中GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)，血清水平和腎組織MDA含量明顯升高(P＜0.01);與模型對照組相比，TWP 9.0和18 mg·kg－1組血清 CAT活性和腎組織中GSH-Px活性明顯升高(P＜0.01)，血清水平和腎組織MDA含量明顯降低(P＜0.01)。

2.3 TWP對DN大鼠腎組織病理變化的影響

由圖1可見，正常對照組腎小球毛細血管腔均勻一致，無狹窄，腎小管間質無炎性細胞浸潤(圖1A);模型對照組腎小球肥大、系膜細胞增生、腎小球變形(圖1B);TWP 9 和18 mg·kg－1與模型對照組相比上述病變明顯減輕(圖1D和 E)，18 mg·kg－1組更加明顯。

Fig.1 Effect of TWP on pathological changes of kidneys of DN rats(HE ×400).See Tab.1 for the rat treatments.A:normal group;B:model group，the arrows show glomerular hypertrophy，mesangial cell proliferation and glomerular deformation.C，D and E:TWP 4.5，9 and 18 mg·kg－1group，respectively，the arrows show significant improvement in renal pathological changes.

3 討論

本研究結果表明，用TWP 8周后大鼠毛色明顯轉好，體質量增加，自發活動亦明顯改善，精神、進食量和飲水量明顯改善，BUN和24 h UAER顯著降低，Clcr明顯升高，表明TWP對DN大鼠腎有保護作用。

研究認為，2型糖尿病的發生、發展及其病程程度與自由基引發和介導的機體氧化損傷及機體抗氧化防御系統清除自由基能力平衡失調密切相關［3－4］。正常狀態下，腎有完整的抗氧化酶保護系統，機體內自由基、過氧化脂質和抗氧化酶之間保持著動態平衡。糖尿病時以腎組織中糖代謝紊亂為主的多種因素造成腎組織中包括過氧化氫、和羥自由基(OH－)在內的反應性氧化產物過多［5］。MDA是機體內活性氧攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化作用，進而形成的過氧化物，其含量的多少可反映機體內脂質過氧化程度，從而間接反映細胞損傷的程度［6］。本研究表明，TWP可降低損傷脂質過氧化物MDA水平和血清中含量。GSH-Px缺乏或耗竭GSH-Px會使許多化學物質或環境因素毒性作用加重，這與氧化損傷具有很大的相關性［7］。CAT也是體內重要的自由基清除劑，可分解H2O2。本研究證實，TWP可降低損傷脂質過氧化物MDA水平，增加腎組織中GSH-Px與CAT的活性。DN大鼠腎組織病理變化表現為腎小球毛細血管呈不規則增厚，腎小球毛細血管腔變狹窄，腎小球肥大、系膜細胞增生、基底膜增厚及突出融合等。本研究結果表明，TWP可減輕DN大鼠腎組織病理變化，劑量較高時，組織病理變化的改善越明顯。

綜上所述，TWP對DN大鼠腎具有一定的保護作用，其機制可能與其降低MDA和含量、升高GSH-Px和CAT活性、抑制氧化應激并增強機體抗氧化能力有關。

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