桑樹組培不定芽對卡那霉素的敏感性研究

劉淑娟，李鎮剛

（云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101）

桑樹是一種重要的經濟作物，是中國養蠶業的飼料基礎，但其組織培養研究起步較晚，筆者經過多年對桑樹組培的研究與探索，已初步建立桑樹高頻再生體系。平野等1985年已證實桑樹為易感農桿菌的植物，并且經過多年來眾多科學家的研究報道證實了通過農桿菌介導的轉基因操作能夠在桑樹中實現。

桑樹的遺傳轉化研究起步較晚，1990年日本學者Machii通過農桿菌將β-葡萄糖苷酸酶（Gus） 基因導入桑樹葉盤并在桑葉中表達獲得成功。自此，國內外許多學者在桑樹轉基因育種這一領域做了大量的研究和探索，有了不少對桑樹的轉基因研究報道，而抗生素對桑樹的敏感性研究則不多?？敲顾啬芨蓴_一般植物細胞葉綠體及線粒體的蛋白質合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導致植物細胞的死亡。因此本研究以桑樹的組織培養為基礎，通過在桑樹叢生芽外植體繼代培養基中添加不同濃度卡那霉素，以確定叢生芽發生黃化的最低濃度，為下一步桑樹遺傳轉化陽性植株的篩選提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試品種為廣西優良雜交桑品種桂優62#的種子，置于4℃低溫保存備用。

1.2 主要培養基

誘導培養基：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L+葡萄糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

繼代培養基：MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+葡萄糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

生根培養基：MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

1.3 培養條件

溫度為25±2℃，光照強度為1 500 lx，每天光照12 h、黑暗12 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 桑樹組培外植體的獲得

參照文獻5的方法，于超凈工作臺上，取預培養萌發的種子剝離種皮，刀片切取子葉和下胚軸靠近生長點的外植體（不帶胚芽），接種到誘導培養基中。在黑暗條件下培養5 d，子葉和胚軸均為乳白色，光照培養2～3 d后，轉變為淡綠色，第5 d時完全變為綠色且體積明顯增大，15 d左右誘導分化，可在切口處形成愈傷組織和不定芽。

1.4.2 桑樹組培不定芽對卡那霉素敏感性試驗

于繼代培養基中添加不同濃度梯度的卡那霉素以制備篩選培養基，將上述獲得的健康不定芽切取分割成獨立的小芽，取大小基本相同的芽接種于篩選培養基中，每瓶接種5個芽，每個濃度梯度接種5瓶，統計芽分化率和及時觀察芽的顏色形態變化。分別進行了3次不同卡那霉素濃度篩選驗證，其濃度梯度如下：第1次：0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，50 mg/L，100 mg/L；第 2次：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，75 mg/L，100 mg/L，125 mg/L；第3次：0 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，60 mg/L，70 mg/L。

2 結果與分析

2.1 桑樹不定芽對卡那霉素耐受濃度的確定

待上述外植體誘導出叢生芽后，切取大小基本相似的獨立的芽進行卡那霉素敏感性研究。從表1可知，卡那霉素濃度在0～150 mg/L，叢生芽的增殖系數隨濃度的升高而降低，卡那霉素對叢生芽的分化具有緩慢抑制的作用。從圖1可知，芽的增殖系數并沒有出現急劇降低的濃度斷點，卡那霉素濃度在100 mg/L下叢生芽亦能分化，說明卡那霉素可以緩慢控制叢生芽的分化率，卡那霉素濃度在150 mg/L下分化率為零，說明高濃度卡那霉素對叢生芽的分化具有完全抑制的潛力。

從圖2可知，卡那霉素濃度在100 mg/L時可以基本認為叢生芽的生長完全受到抑制。如圖3a，白化現象在卡那霉素濃度為50 mg/L時出現，僅葉尖出現黃色，生長和分化正常?？敲顾貪舛?0 mg/L以下沒有白化現象，原因可能是在低濃度下，叢生芽本身的抵抗力可以維持基本生長，隨濃度的增加芽的分化率降低。

表1 不同卡那霉素濃度對叢生芽分化的影響

圖1 不同卡那霉素濃度對芽增殖系數的影響

圖2 不同卡那霉素濃度與芽白化率的關系

2.2 卡那霉素對叢生芽生長的影響

從表2可知，卡那霉素濃度在30～50 mg/L時叢生芽生長基本不受影響，隨著卡那霉素濃度的增加其長度明顯變短?？敲顾貙χ参锛毎纳L發育有影響，能夠引起玉米、小麥、煙草、番茄等多種植物綠色器官的黃化和白化，其毒性機理主要是卡那霉素與植物細胞器葉綠體和線粒體的核糖30S亞基結合，阻止翻譯過程，干擾蛋白質合成，引起試管苗同化作用受阻，生長受到抑制，長勢變弱，如圖3b，隨著卡那霉素濃度的遞增白化明顯，長勢變弱。

表2 不同卡那霉素濃度對叢生芽生長的影響

圖3 叢生芽的生長情況

圖4 不同濃度叢生芽葉子顏色的變化

如圖3和圖4所示，卡那霉素濃度在50 mg/L時葉片邊緣出現乳黃色的現象，不過生長未受到抑制，說明此時的濃度已經對芽的葉綠體與線粒體的蛋白質合成產生了一定的干擾作用，導致其開始黃化，能正常分化說明其濃度還不足以造成芽的死亡。當卡那霉素濃度大于60 mg/L則黃化較嚴重，芽的分化和生長也受到抑制，由此選擇卡那霉素濃度50 mg/L為桑樹叢生芽遺傳轉化陽性苗篩選的臨界濃度，則不會對桑樹叢生芽的生長產生影響。

3 討論

外源基因遺傳轉化受體系統需具備以下幾個條件：用于遺傳轉化的外植體應該要具備高效穩定的再生能力；外植體來源要具有穩定性；遺傳穩定性良好；對選擇抗生素具敏感性，對農桿菌的浸染也要具有敏感性。經由本研究室多年的研究與探索，利用子葉和下胚軸作為外植體，通過不同濃度和種類的植物激素處理能夠穩定的再生出桑樹植株。平野等1985年已證實桑樹為易感農桿菌的植物，并且經過多年來眾多科技工作者的研究報道，證實通過農桿菌介導的基因轉化操作能夠在桑樹中實現。本研究采用桑組培外植體叢生芽為遺傳轉化操作的受體，探討了未轉化叢生芽在添加卡那霉素的培養基中出現白化現象但不影響正常分化的適宜濃度。在前人的研究中，大都利用葉盤轉化法獲得了轉基因植株，而對于木本植物的桑樹而言，葉盤再生比較困難，因而制約了桑樹基因轉化的研究進程，因此本試驗采用桑組培叢生芽作為遺傳轉化的載體，探討了卡那霉素對未轉化桑組培叢生芽的最低致死濃度，用于遺傳轉化陽性植株的篩選。理論上選用的卡那霉素濃度越高選擇效果會越好，但是過高的濃度對細胞有強毒害性，此時細胞將快速死亡，死亡的或將要死亡的細胞會分泌一定的毒素對臨近的細胞產生抑制作用，也不利于轉化細胞的生長分化。在卡那霉素濃度50 mg/L時即出現葉尖白化現象但能正常生長、分化，卡那霉素濃度在60 mg/L及以上時桑組培外植體叢生芽的分化和芽的伸長均受到較大程度的抑制，根據試驗結果，筆者選擇卡那霉素濃度50 mg/L為桑組培叢生芽作為遺傳轉化受體陽性轉化苗的篩選臨界濃度。

[1]Machii H.Leaf disk transformation of mulberry plant（Morus alba L.）by Agrobacterium Ti-plasmid[J].J.Seric.Sct.Jpn.，1990，59（2）：105-110.

[2]王勇.抗生素對桑樹外植體生長與分化的影響[J].蠶業科學，1996，22（2）：72-76.

[3]王關林，方宏筠.植物基因工程（第二版）[M].北京：科學出版社，2002.

[4]Dong C Z，Jiang C X.Transgenic tomato and pepper plants containing CMV Sat-RNA cDNA[J].Acta.Horticulture，1995，402：78-86.

[5]王茜齡，余茂德，徐立.桑子葉與胚軸不同區段離體再生植株的研究[J].蠶業科學，2005，31（3）：334-336.

[6]肖婭萍，胡雅琴，王枯之.卡那霉素對地靈愈傷組織誘導和生長的影響[J].西北植物學報，2003，23（2）：3l8-322.

[7]王丕武，張曉玲.卡那霉素對大豆種子發芽的影響[J].吉林農業大學學報，1996，18（4）：8-21.

[8]劉剛，黃蓋群，殷浩，等.氮磷鉀肥施用量對桑樹生長發育及干物質積累的影響[J].西南農業學報，2013，26（1）：230-236.

[9]王世杰，歐行奇.作物育種學總論[M].北京：中國農業科學技術出版社，2009.