抗犬瘟熱病毒與犬細(xì)小病毒特異性免疫制劑的檢測(cè)

陳超陽 和彥良 霍志云 程俊生

近年來，隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國的寵物文化也相應(yīng)有了較大的提升，越來越多的寵物進(jìn)入到人們的日常生活中，它們已經(jīng)成為眾多人生活中的重要組成部分。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在飼養(yǎng)寵物的人群中，大約80%的人飼養(yǎng)寵物犬，因此犬的健康問題也越來越引起人們的重視，寵物犬在飼養(yǎng)中遇到的常見病比較多，其中犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病因其傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、死亡率高，已成為危害我國養(yǎng)犬業(yè)的主要傳染病。

目前，疫苗免疫注射對(duì)預(yù)防這兩種病取得了一定效果，但由于受疫苗自身、免疫程序、母源抗體及個(gè)體差異等多種因素的影響，仍有部分免疫犬因感染而發(fā)病，因此對(duì)犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病的被動(dòng)免疫和疾病早期的有效治療也成為該疾病防治的重要措施。大量的臨床治療案例表明，在兩種疾病的早期，皮下或肌肉注射特異性抗血清和單克隆抗體可收到較好的治療效果。但由于目前市場上出售的抗血清和單克隆抗體種類繁多，存在使用說明不詳，使用方法不同，特別是所含抗體水平不明確等問題，這對(duì)疾病的臨床有效治療造成了一定影響。為給寵物醫(yī)院的臨床治療提供一定的參考信息，作者對(duì)泰州市多家寵物醫(yī)院的抗血清和單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，并作報(bào)告一份。

一、材料與方法

（一）材料

1.抗體及制劑 犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）高免血清（二聯(lián)、五聯(lián)）及單克隆抗體購自江蘇省泰州市內(nèi)多家寵物醫(yī)院；抗犬瘟熱病毒陽性血清、抗犬細(xì)小病毒陽性血清由本公司研發(fā)部自行研制；犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒中和抗原由本公司研發(fā)部制備保存。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器 微量移液器、低速離心機(jī)等。

（二）方法

1. 制劑的細(xì)菌培養(yǎng) 無菌條件下每種制劑各取100μl 分別加入到5ml 無抗性LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、210r/min 培養(yǎng)5 天，觀察是否有菌生長。

2. 制劑中犬瘟熱病毒抗體中和效價(jià)測(cè)定 按本公司《犬瘟熱病毒中和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》的方法進(jìn)行。犬瘟熱病毒抗體中和效價(jià)（SN）判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

3. 制劑中犬細(xì)小病毒抗體的血凝抑制效價(jià)測(cè)定 按本公司《細(xì)小病毒血凝抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》的方法進(jìn)行。犬細(xì)小病毒抗體的血凝抑制（HI）效價(jià)判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 犬瘟熱病毒與犬細(xì)小病毒抗體效價(jià)判定標(biāo)準(zhǔn)

二、結(jié)果與分析

（一）通過制劑的細(xì)菌培養(yǎng)，對(duì)寵物醫(yī)院使用的犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒高免血清及單克隆抗體進(jìn)行了無菌檢測(cè)，共4個(gè)品牌，8 份樣品。結(jié)果顯示品牌2 的犬五聯(lián) （犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬副流感病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬冠狀病毒）高免血清在培養(yǎng)的第2天，LB 液體培養(yǎng)基即出現(xiàn)嚴(yán)重的渾濁現(xiàn)象，表明該制劑存在著大量細(xì)菌污染；其他制劑培養(yǎng)物培養(yǎng)5 天后均無菌生長，較為潔凈。結(jié)果詳見表2。

表2 8 份制劑的無菌檢驗(yàn)結(jié)果

（二）試驗(yàn)對(duì)8 份特異性免疫制劑同時(shí)進(jìn)行犬瘟熱病毒抗體中和效價(jià)的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示品牌1 的兩種制劑中犬瘟熱中和抗體效價(jià)均為1∶4，判定結(jié)果為無抗體；品牌2 與品牌3 制劑中的犬瘟熱中和抗體效價(jià)均為1∶32，水平較弱；品牌4 制劑中犬瘟熱中和抗體效價(jià)均為1∶64，水平一般。但在品牌2、3、4 的抗犬細(xì)小病毒的特異性免疫制劑中均檢測(cè)到了不同水平的犬瘟熱中和抗體，其中品牌3 的犬細(xì)小病毒單克隆抗體的犬瘟熱病毒中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶128。結(jié)果詳見表3。隆抗體中也檢測(cè)到了不同水平的犬細(xì)小病毒抗體。結(jié)果詳見表4。

表3 8 份制劑中犬瘟熱病毒抗體中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

（三）試驗(yàn)對(duì)8 份特異性免疫制劑同時(shí)進(jìn)行犬細(xì)小病毒抗體的血凝抑制(HI)效價(jià)的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示抗體水平最低的為品牌1，其兩種制劑中犬細(xì)小病毒抗體的HI效價(jià)均為1∶80；抗體水平最高的為品牌3，其犬細(xì)小病毒單克隆抗體的HI 效價(jià)可達(dá)1∶640。同樣，在品牌3 和品牌4 的犬瘟熱單克

三、討論

本試驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明，大部分品牌還是保證了特異性生物制品沒有細(xì)菌污染，但品牌2 的犬五聯(lián)高免血清出現(xiàn)了嚴(yán)重的細(xì)菌污染，說明同一廠家不同產(chǎn)品之間還是存在一定的差異，由此提醒臨床上的寵物醫(yī)生在使用同一品牌不同產(chǎn)品時(shí)還是要謹(jǐn)慎對(duì)待，制劑溶解后出現(xiàn)混濁、沉淀的應(yīng)禁止使用，對(duì)建議靜脈滴注的制劑需更加小心謹(jǐn)慎，避免寵物醫(yī)療事故的發(fā)生。

表4 8 份制劑的犬細(xì)小病毒抗體血凝抑制效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：抗犬瘟熱中和效價(jià)達(dá)到1∶40，抗犬細(xì)小病毒的HI 效價(jià)達(dá)到1∶80，即可安全保護(hù)犬免受犬瘟熱和犬細(xì)小病毒的攻擊。制劑的抗體檢測(cè)結(jié)果表明，不論是高免血清，還是單克隆抗體，不同品牌之間存在著較大的差異，部分品牌的制劑還可能會(huì)出現(xiàn)抗體極低、無抗體，甚至出現(xiàn)單一抗體制劑中會(huì)含有另一種抗體成分的情況。這提醒寵物醫(yī)生在臨床治療中需要做到因藥而異，不能一貫的采取相同的治療劑量與方法，對(duì)于治療效果不明顯的，應(yīng)重新選擇以提高臨床治療效果。

通過走訪多家寵物醫(yī)院發(fā)現(xiàn)，寵物醫(yī)生在臨床上使用的抗犬瘟熱病毒或犬細(xì)小病毒的高免血清和單克隆抗體的牌子多、規(guī)格亂，且有很大一部分產(chǎn)品并沒有獲得農(nóng)業(yè)部新獸藥注冊(cè)證書，因此給臨床上疾病的及時(shí)、準(zhǔn)確、有效的治療帶來了很大的隱患與風(fēng)險(xiǎn)，這需要相關(guān)獸藥監(jiān)管部門加大、加強(qiáng)對(duì)特異性免疫制劑這類產(chǎn)品的監(jiān)管與查處力度，同時(shí)相關(guān)主管部門也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)寵物醫(yī)院的監(jiān)管，以及對(duì)寵物醫(yī)生的培訓(xùn)教育和宣傳指導(dǎo)，進(jìn)一步規(guī)范寵物醫(yī)療市場。