RAD51及CHK1在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及意義

張曉嵐

[摘要] 目的 探討RAD51及CHK1在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及意義。 方法 收集2012年1～12月于河北省眼科醫院，經病理確診且未經放化療的喉鱗狀細胞癌患者50例的癌組織、同一患者相對應的50例癌旁黏膜組織及17例非喉部惡性腫瘤疾病患者的喉部正常黏膜組織，采用免疫組化二步法檢測標本組織中RAD51、CHK1的表達，分析二者間的關系。 結果 喉鱗狀細胞癌組織中RAD51的陽性率（74.00%）明顯高于相對應的癌旁黏膜組織（22.00%），差異有統計學意義（χ2=11.235，P = 0.014）；也高于非喉部惡性腫瘤疾病患者的喉部正常黏膜組織（17.64%），差異有高度統計學意義（χ2=12.346，P = 0.001）。喉鱗狀細胞癌組織中CHK1陽性率（78.00%）高于癌旁黏膜組織（16.00%），差異有統計學意義（χ2=9.235，P = 0.041）；也高于正常黏膜組織（11.76%），差異有統計學意義（χ2=11.386，P = 0.010）；癌旁組織中CHK1的陽性率高于正常組織，但差異無統計學意義（χ2=1.245，P = 0.612）。RAD51的陽性高表達與喉鱗狀細胞癌的病理分級、淋巴結的轉移、臨床分期有關（P < 0.05）；CHK1的陽性表達與喉鱗狀細胞癌的病理分級、淋巴結的轉移、臨床分期有關（P < 0.05）。喉鱗狀細胞癌組織中RAD51的表達與CHK1的表達呈正相關（r = 0.432，P < 0.01）。 結論 RAD51、CHK1在喉鱗狀細胞癌組織中呈高表達，其表達與病理分級淋巴結的轉移及臨床分期有關，提示RAD51及CHK1的表達可能與喉鱗狀細胞癌的預后和轉移有關。

[關鍵詞] 喉鱗狀細胞癌；RAD51、CHK1；免疫組織化學

[中圖分類號] R739.65 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）10（a）-0019-05

Epression and significance of RAD51 and CHK1 in laryngeal squamous cell carcinoma tissue

ZHANG Xiaolan

Department of Ear-nose-throat， Eye Hospital of Hebei Province， Hebei Province， Xingtai 054001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of RAD51 and CHK1 in laryngeal squamous cell carcinoma tissue. Methods From January to December 2012， in Eye Hospital of Hebei Province， 50 cases of carcinoma tissue from 50 patiens with pathologically confirmed laryngeal squamous cell carcinoma without chemotherapy， 50 cases of cancer adjacent normal mucosa tissues form the same patients and 17 cases non-malignant diseases's normal mucosa tisssue were selected， the expression of RAD51 and CHK1 in these tissue were deteced by two-step immunohistochemical methods. The correlation between RAD51 and CHK1 were analyzed. Results The RAD51 positive rate of laryngeal squamous cell carcinoma tissue （74.00%） was significantly higher than that of the cancer adjacent normal mucosa tissue （22.00%）， the difference was statistically significant （χ2=11.235， P = 0.014）， also higher than that of the non-malignant diseases's normal mucosa tisssue （17.64%）， the difference was statistically significant （χ2=12.346，P = 0.001）. The CHK1 positive rate of laryngeal squamous cell carcinoma tissue （78.00%） was higher than that of the cancer adjacent normal mucosa tissue （16.00%）， the difference was statistically significant （χ2=9.235，P = 0.041）； aslo higher than that of the non-malignant diseases's normal mucosa tisssue （11.76%）， the difference was statistically significant （χ2=11.386，P = 0.010）； the CHK1 positive rate of the cancer adjacent normal mucosa tissue was higher than that of normal mucosa tisssue， but the difference was not statistically significant （χ2=1.245，P = 0.612）. The RAD51 expression positive rate of laryngeal squamous cell carcinom tissue had related with the pathological grade， lymph node metastasis and clinical stage （P < 0.05）. The CHK1 expression positive rate of laryngeal squamous cell carcinoma had related with pathological grade of laryngeal， lymph node metastasis and clinical stage （P < 0.05）. The expression of RAD51 of laryngeal squamous cell carcinoma tissue was positively correlated with CHK1 （r = 0.432， P < 0.01）. Conclusion RAD51 and CHK1 showes high expression in laryngeal squamous cell carcinoma tissue， and its expression closely related with histological grade， lymph node metastasis and TNM stage. It suggests that RAD51 and CHK1 expression may be associated with laryngeal cancer prognosis and metastasis.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； RAD51； CHK1； Immunohistochemistry

喉鱗狀細胞癌是頭頸部腫瘤中常見的惡性腫瘤，惡性度高，易發生局部復發及遠處轉移，其發生、發展、預后及轉移的研究已經成為了耳鼻咽喉-頭頸外科的研究熱點。細胞周期檢測點激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）是在生物進化過程中極為保守的蛋白激酶，研究表明CHK1在人類許多惡性腫瘤中均有表達，可能與腫瘤的發生、發展及預后有關[1]。RAD51基因是細胞DNA修復系統中的重要組成部分，研究表明RAD51在人類許多惡性腫瘤中也呈高表達[2]。本研究應用免疫組織化學方法檢測RAD51及CHK1在喉鱗狀細胞癌組織、對應的癌旁正常黏膜組織及非喉部惡性腫瘤疾病患者的正常黏膜組織中的表達情況，并探討二者間的關系，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2012年1～12月于河北省眼科醫院（以下簡稱“我院”）手術治療經病理確診的喉鱗狀細胞癌患者50例，切取其喉鱗狀細胞癌組織及同一患者的癌旁正常黏膜組織50例。另收集同期我院手術治療的非喉部惡性腫瘤疾病（如聲帶息肉等）患者的喉部正常黏膜組織17例。喉鱗狀細胞癌患者中男47例，女3例；年齡46～79歲，中位年齡59.5歲；年齡≤59歲12例，年齡>59歲38例；癌腫直徑≤2 cm 34例，>2 cm 16例；分型：聲門上型17例，聲門型32例，聲門下型1例；病理學分級：G1+G2級29例，G3級21例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期31例；淋巴結轉移者（N+）29例，無淋巴結轉移者（N0）21例。非喉部惡性腫瘤疾病患者中男12例，女5例；年齡42～76歲，中位年齡56.2歲。喉鱗狀細胞癌患者與非喉部惡性腫瘤疾病患者的年齡、性別比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

采用免疫組織化學二步法。標本離體后1 h內采集，置入速凍管，迅速保存于-80℃冰箱內。將選取的50例喉鱗狀細胞癌組織、對應的50例癌旁黏膜組織和17例正常喉黏膜組織常規福爾馬林固定、石蠟包埋、4 μm切片。實驗試劑包括CHK1兔抗人多克隆抗體、RAD51兔抗人多克隆抗體、兔二抗免疫組化試劑盒、鼠二抗免疫組化試劑盒、DAB顯色液。用PBS代替一抗孵育切片為空白對照。

1.3 結果判定

RAD51及CHK1陽性染色是細胞漿中出現棕黃色或棕褐色異染顆粒，周圍間質部分有著色為準，其中陽性染色結果的判斷標準根據著色強度和陽性細胞百分率采用半定量積分法判斷分析結果[3]。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗。相關性采用Spearman相關性分析。以P < 0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 喉鱗狀細胞癌組織、癌旁黏膜組織、正常黏膜組中RAD51、CHK1陽性率情況

喉鱗狀細胞癌組織中RAD51的陽性率明顯高于相對應的癌旁黏膜組織，差異有統計學意義（χ2=11.235，P = 0.014）；也高于非喉部惡性腫瘤疾病患者的喉部正常黏膜組織，差異有高度統計學意義（χ2= 12.346，P = 0.001）。喉鱗狀細胞癌組織中CHK1陽性率高于癌旁黏膜組織，差異有統計學意義（χ2= 9.235，P = 0.041）；喉鱗狀細胞癌組織中CHK1的陽性率高于正常黏膜組織，差異有統計學意義（χ2=11.386，P = 0.010）；癌旁組織中CHK1的陽性率高于正常組織，但差異無統計學意義（χ2=1.245，P = 0.612）。見表1。

表1 喉鱗狀細胞癌組織、癌旁黏膜組織、正常黏膜組中RAD51、CHK1陽性率情況（例）

2.2 RAD51及CHK1在喉鱗狀細胞中的表達與臨床特征的關系

2.2.1 RAD51在喉鱗狀細胞癌中的表達與臨床特征的關系 N+的喉鱗狀細胞癌組織中RAD51的陽性率高于N0，差異有統計學意義（P < 0.05）。RAD51在Ⅲ、Ⅳ期喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，差異有統計學意義（P < 0.05）。RAD51在喉鱗狀細胞癌病理分級G1+G2級組織中的陽性率低于G3級，差異有統計學意義（P < 0.05）。RAD51在吸煙量（支/d×年）>400和吸煙量≤400的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。RAD51在腫瘤直徑≤2 cm和腫瘤直徑>2 cm的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。RAD51在喉鱗狀細胞癌的臨床分型中的聲門上型、聲門型、聲門下型的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。RAD51在喉鱗狀細胞癌中年齡>59歲和年齡≤59歲的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。RAD51在男、女性喉鱗狀細胞癌中的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。說明RAD51的陽性表達與喉鱗狀細胞癌的病理分級、淋巴結的轉移、臨床分期有關，與吸煙量、腫瘤的大小、臨床分型、性別及年齡無關。

表2 喉鱗狀細胞癌組織中RAD51陽性表達與臨床、病理特征的關系

2.2.2 CHK1在喉鱗狀細胞癌中的表達與臨床特征的關系 CHK1在有N+的喉鱗狀細胞癌組織中陽性率高于N0，差異有統計學意義（P < 0.05）。CHK1在Ⅲ、Ⅳ期陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，差異有統計學意義（P < 0.05）。CHK1在喉鱗狀細胞癌病理分級G1+G2級組織中陽性率低于G3級陽性率，差異有統計學意義（P < 0.05）。CHK1在吸煙量（支/d×年）>400和吸煙量≤400的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。CHK1在腫瘤直徑≤2 cm和腫瘤直徑>2 cm的陽性率分差異無統計學意義（P > 0.05）。CHK1在喉鱗狀細胞癌臨床分型有聲門上型、聲門型、聲門下型中的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。CHK1在年齡>59歲和年齡≤59歲的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。CHK1在男、女性喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率差異無統計學意義（P > 0.05）。說明CHK1的陽性表達與喉鱗狀細胞癌的病理分級、淋巴結的轉移、臨床分期有關，與吸煙量、腫瘤的大小、臨床分型、性別及年齡無關。見表3。

表3 喉鱗狀細胞癌組織中CHK1陽性表達與臨床、病理特征的關系

2.3 喉鱗狀細胞癌組織中RAD51表達與CHK1表達的關系

經Spearman相關分析顯示喉鱗狀細胞癌組織中RAD51的表達與CHK1的表達呈正相關（r = 0.432，P < 0.01）。見表4。

表4 喉癌組織中RAD51表達與CHK1表達的關系

3 討論

喉鱗狀細胞癌發病的重要機制之一是某些因素破壞了細胞的增殖、修復與凋亡之間的平衡。研究表明腫瘤細胞的耐藥與其逃避凋亡及DNA的過度修復有關，而細胞的凋亡與細胞周期檢測點調節有關[4]。在細胞周期檢測點的調節中，CHK1起著非常重要的作用，RAD51是體內參與同源重組DNA修復的關鍵酶之一[5]。研究發現CHK1和RAD51在多種惡性腫瘤中表達均高于正常組織，因此檢測喉鱗狀細胞癌組織中CHK1和RAD51有助于為喉鱗狀細胞癌的臨床治療、評估喉鱗狀細胞癌預后提供依據。

3.1 RAD51表達與喉鱗狀細胞癌間的關系

人類的RAD51蛋白主要功能是參與了DNA雙鏈的修復和重組，在DNA雙鏈進行鏈間轉移置換時，RAD51是催化此過程的關鍵酶。研究發現RAD51水平下降降低了同源重組修復DNA雙鏈的準確性，破壞了其他重組修復途徑，使DNA損傷檢查點平衡失調，引起基因組的不穩定，促進了腫瘤的發生，說明RAD51蛋白表達水平的失調促進了腫瘤的發生、發展[6-9]。許俊[10]采用免疫組化SP法檢測60例肺鱗狀細胞癌組織RAD51蛋白陽性率（33.33%）明顯高于15例癌旁正常組織中RAD51蛋白陽性表達（6.67%）。本研究結果與上述研究一致。本研究顯示：RAD51在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率明顯高于癌旁黏膜組織及正常喉黏膜組織，提示RAD51在喉鱗狀細胞癌組織中的高表達可能與喉鱗狀細胞癌的發生、發展有關。且RAD51在喉鱗狀細胞癌中的表達與臨床特征的關系顯示：喉鱗狀細胞癌晚期有淋巴結轉移時，RAD51的表達增強，低中分化RAD51的表達增強，而在高分化中的表達相對較弱，病理分化程度越低RAD51表達越強，說明RAD51的表達越弱腫瘤的惡性程度就越低。RAD51還在有淋巴結轉移組中有著高表達，提示它可能影響了腫瘤的轉移，RAD51表達越高預后越差[13-14]。

3.2 CHK1表達與喉鱗狀細胞癌之間的關系

CHK1是一種調控基因，主要參與了細胞周期中G2/M期的調控。當細胞的DNA雙鏈發生損傷后，CHK1激活一系列過程，導致細胞周期阻滯。它同時還激活了DNA損傷的修復系統，最終維護細胞的穩定性，從而使細胞能夠正常的增殖分化，避免了細胞的凋亡[15-16]。本研究結果表明：CHK1在喉鱗狀細胞癌組織中的陽性率明顯高于癌旁黏膜組織及非喉部惡性腫瘤的正常黏膜組織，但后二者表達無差異，提示CHK1在喉鱗狀細胞癌組織中高表達可能與喉鱗狀細胞癌的發生、發展有關。申帥[17]的研究表明CHK1蛋白表達有隨Dukes分期提升而提高的傾向，癌組織與癌旁正常組織中CHK1蛋白的表達有顯著差異，提示CHK1與結腸癌的發生發展及預后有密切關系。本研究CHK1在喉鱗狀細胞癌中的表達與臨床特征的關系顯示：喉鱗狀細胞癌到了晚期有淋巴結轉移時，CHK1的表達明顯增強，在低中分化中CHK1的表達增強，而在高分化中的表達相對較弱，病理分化程度越低CHK1表達越強，說明CHK1表達越強腫瘤的惡性程度就越高。CHK1還在有淋巴結轉移組中明顯高表達，說明它可能會影響腫瘤的轉移，而有轉移的腫瘤預后較差，進一步說明了通過監測CHK1的表達可能可以預測腫瘤的預后。

3.3 RAD51及CHK1在喉鱗狀細胞癌中二者表達的相關性

本研究發現RAD51及CHK1在喉鱗狀細胞癌組織中均為高表達，且RAD51及CHK1間呈正相關，但具體作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，RAD51及CHK1共同參與了喉鱗狀細胞癌的發生及發展過程，二者可以作為惡性腫瘤的分期分級和判斷惡性程度的標志，研究其表達可以為腫瘤患者的預后提供依據。

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（收稿日期：2014-06-13 本文編輯：蘇 暢）

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（收稿日期：2014-06-13 本文編輯：蘇 暢）