夜蛾科昆蟲(chóng)高毒力蘇云金桿菌菌株的分離和篩選

白 雪 峰

（山東省滕州市植保植檢站，山東 滕州 277599）

蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在形成芽孢的同時(shí)能產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs），目前已知其對(duì)節(jié)肢動(dòng)物門(mén)的鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、同翅目、直翅目等9個(gè)目和線(xiàn)蟲(chóng)等無(wú)脊椎動(dòng)物有活性[1]。夜蛾科害蟲(chóng)是一類(lèi)重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，其對(duì)Bt低度敏感[2]。Christeller等[3]報(bào)道了夜蛾科幼蟲(chóng)中腸液的總蛋白酶活性較高，對(duì)Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白能過(guò)度降解。邵宗澤等報(bào)道了與對(duì)Bt敏感昆蟲(chóng)家蠶相對(duì)比，粘蟲(chóng)中腸液具有較高的蛋白酶活性，這可能與粘蟲(chóng)（Mythimna separata）及其它夜蛾科害蟲(chóng)對(duì)Bt低度敏感有關(guān)[4]。本試驗(yàn)從山東省采集的土樣中分離Bt菌株，然后通過(guò)生物測(cè)定篩選對(duì)夜蛾科高毒力的Bt菌株。

1 材料和方法

1.1 材 料

土樣采自山東省17個(gè)地級(jí)市，均為非耕地土壤。生測(cè)用的甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、粘蟲(chóng)、棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）均由本站養(yǎng)蟲(chóng)室提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1來(lái)自本站保存的菌株，其它Bt菌株均為本文從山東省土壤中分離出的Bt菌株。培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基和NGKG選擇性培養(yǎng)基（日水制藥），其他常用生化試劑均為市售分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Bt菌株的分離將1 g土壤懸浮于10mL無(wú)菌水中，劇烈震蕩20min，然后靜置5min。將上層懸液稀釋100倍，取80μL涂于選擇性培養(yǎng)基（NGKG）平板上，30℃倒置培養(yǎng)72h。經(jīng)無(wú)菌操作，用接種環(huán)挑外觀似芽孢桿菌的單個(gè)菌落，用碳酸復(fù)紅染色后，鏡檢有無(wú)晶體。將鏡檢到有晶體的菌落劃線(xiàn)純化，于斜面LB培養(yǎng)基上4℃保存。

1.2.2 室內(nèi)生物測(cè)定Bt菌液的制備采用固體LB平板法。將Bt接種于固體LB平板上，30℃培養(yǎng)72h，鏡檢到晶體出現(xiàn)后，將菌體從LB平板上刮下，混合于5mL滅菌水中。然后通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，并調(diào)節(jié)菌液濃度為6.0×108cells/mL。

生物測(cè)定采用人工飼料混合法。將200μL菌液與2 g飼料充分混合，分裝到24孔板中，以滅菌水處理飼料作對(duì)照，各處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)24頭初孵幼蟲(chóng)，置28℃、相對(duì)濕度70%~80%光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48、72、96 h檢查死蟲(chóng)數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株的分離

采用選擇性培養(yǎng)基法，從山東省采集的750份土樣中，共分離出Bt菌株57株，平均分出率為7.6%。分出菌株的晶體形態(tài)包括菱形、圓形、不規(guī)則形、正方形和混雜型（菱形和圓形），所占比例分別為36.8%、36.8%、15.8%、5.3%、5.3%。

2.2 高毒力Bt菌株的篩選

以粘蟲(chóng)和甜菜夜蛾初孵幼蟲(chóng)為試蟲(chóng)，對(duì)分離的57株Bt菌株進(jìn)行毒力測(cè)定。結(jié)果表明，96 h后對(duì)粘蟲(chóng)校正死亡率高于50%的有菌株QCL-1、QJN-1、WRC-1；對(duì)甜菜夜蛾校正死亡率高于50%的有菌株QCL-1、WRC-1、HJY-1。絕大部分Bt菌株對(duì)試蟲(chóng)的校正死亡率低于50%，可見(jiàn)夜蛾科的這2種試蟲(chóng)對(duì)Bt不敏感（圖1和圖2）。

圖1 高毒力菌株對(duì)粘蟲(chóng)的校正死亡率

圖2 高毒力菌株對(duì)甜菜夜蛾的校正死亡率

菌株QCL-1對(duì)粘蟲(chóng)和甜菜夜蛾都表現(xiàn)出了較高的毒力。為進(jìn)一步明確菌株QCL-1毒力，以粘蟲(chóng)、甜菜夜蛾、棉鈴蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)為試蟲(chóng)，對(duì)菌株QCL-1和標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1的96 h的校正死亡率進(jìn)行對(duì)比（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，菌株QCL-1對(duì)甜菜夜蛾的校正死亡率為81.47%，高于菌株HD-1的33.6%，兩者差異顯著；菌株QCL-1和HD-1對(duì)粘蟲(chóng)的校正死亡率都超過(guò)了85.42%，差異不顯著；菌株QCL-1對(duì)棉鈴蟲(chóng)的校正死亡率為43.36%，低于HD-1的73.24%，兩者差異顯著。通過(guò)毒力比較，可以確定菌株QCL-1是一株對(duì)甜菜夜蛾和粘蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)具有較高毒力的Bt菌株。

表1 菌株QCL-1與HD-1的毒力比較

3 討 論

Bt菌株對(duì)夜蛾科中甜菜夜蛾和粘蟲(chóng)活性較低[5]，而甜菜夜蛾和粘蟲(chóng)均為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的害蟲(chóng)，因而尋找對(duì)甜菜夜蛾和粘蟲(chóng)高毒力的Bt菌株，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要意義。本試驗(yàn)采用夜蛾科中這兩種昆蟲(chóng)為試蟲(chóng)進(jìn)行高毒力菌株的初步篩選，通過(guò)初篩選出了一株對(duì)兩種試蟲(chóng)均有高毒力的菌株QCL-1。將該菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1對(duì)比，其對(duì)甜菜夜蛾的毒力高于HD-1，對(duì)粘蟲(chóng)的毒力與HD-1相當(dāng)，該菌株的發(fā)現(xiàn)為夜蛾科害蟲(chóng)中粘蟲(chóng)和甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株資源。

[1]Schnepf E,Crickmore N,Van R J,et al.Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins[J].Microbiology and Molecular Biology Review,1998,62(3):775-806.

[2]Hofte H,Whiteley H R.Insecticidal proteins ofBacillus thuringiensis[J].Microbiol Mol Biol Rev,1989,53(2):242-255.

[3]Christeller J T,Laing W A,Markwick N P,et al.Midgut protease activities in 12 phytophagous Lepidopteran larvae:dietary and protease inhhibitor interactions[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,1992,22:735-746.

[4]邵宗澤,喻子牛.粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體低度敏感的機(jī)理探討[J].中國(guó)生物防治,1999,15(2):66-69.

[5]Beegle C C,Yamamoto T.History ofBacillus thuringiensisBerliner Research and Development[J].Can Entomologist,1992,124:587-616.