云南省中醫藥治療艾滋病生物樣本庫的建立與管理*

宋娜麗， 楊玉琪， 趙 遠， 喬金麗， 汪林芬， 張媛

(1.云南省中醫中藥研究院， 云南 昆明 650223； 2.大理學院， 云南 大理 671000)

生物樣本庫(Biobank)也稱生物信息庫或生物材料和數據庫，指的是長期保存的人體材料和樣本，這些樣本可與個人數據及有關它們供者的信息相聯系或沒有聯系。人體組織的樣本包括細胞、組織和血液以及作為遺傳信息物質的DNA。經濟合作與發展組織(OECD)定義為：生物樣本庫是一種集中保存各種人類生物材料(Human biological material)，用于疾病的臨床治療和生命科學研究的生物應用系統。云南省是我國艾滋病的高發區，感染者具有多民族、多途徑感染的特點，使云南省艾滋病感染者防治的研究頗具代表性。自2005年云南省中醫藥治療艾滋病試點項目開展以來，截止2014年2月底，已累計治療感染者11806例，正在治療6791例。規范管理并長期保存依從性好、治療有效的感染者標本，為我省、乃至全國科研工作者提供有價值的樣本，是本院工作人員考慮的工作重點之一。本研究將以“珍惜樣本、執行標準、充分應用、維護產權”為原則和宗旨[1]，初步建立云南省中醫藥治療艾滋病生物樣本庫，并實施信息化管理。

1 材料與方法

1.1 材料 海爾-80℃冰箱，金鳳牌YDS-50B-125型液氮罐，貝克曼血球計數儀、生物安全柜、超凈工作臺、離心機、德國產2 mL凍存管，凍存管盒、淋巴細胞分離液、胎牛血清、DMSO、PBS、抗凝、促凝采血管，采血針等。

1.2 標本的采集、分裝

1.2.1 全血：按照血液采集標準操作規程(下同)，取2 mL抗凝全血直接分裝于凍存管，1管/人。置入-20℃冰箱，過夜轉入-80℃。

1.2.2 血清、血漿、白細胞、紅細胞 分別取促凝管和抗凝管采4～6 mL全血，2200 rpm/min水平離心10 min，無菌移液器分別吸出血清、血漿、抗凝管中間白細胞層以及下層紅細胞，分別裝入凍存管中，1.5 mL/管，1～2管/人。

1.2.3 外周血單核細胞(PBMC) 離心后的抗凝全血，取血漿保存后，將剩余血細胞用PBS緩沖液按1：1等倍稀釋，輕吹使其充分混勻后，緩緩加入有淋巴細胞分離液的離心管。加入時離心管傾斜45度角，用軟吸管先浸潤離心管壁，在距分離液上方1 cm處，使稀釋液重疊于分層液之上(加入時勿破壞液面，并保持兩界面清晰，勿沖破淋巴細胞分離液界面)，水平離心機2200 rpm/min離心20 min，用無菌吸管吸取白細胞層，置另一15 mL離心管中，重復洗3次。血球計數儀計數細胞，加細胞凍存液保存于凍存管。

1.3 樣本保存 所有保存樣本依據編號規則確定唯一編號后，放入凍存盒置-20℃冰箱過夜，再轉入-80℃，整理后放液氮罐長期保存。PBMC最好采用程序性降溫盒降溫后置液氮罐保存，可大大提高細胞凍存的存活率。

2 結果

本研究已收集中醫藥治療1年以上且有效的艾滋病血液標本共50余例，近300份，并收集血液樣本捐贈者基本信息及歷次生化、血常規、CD4和病毒載量等檢測結果，可用于云南省中醫藥治療艾滋病藥物作用靶點等相關研究，熟悉云南省中醫藥治療艾滋病血液樣本庫的建立與信息化管理，自血液樣本庫建立以來，各環節正常運行。

3 知情同意

知情同意[2～3]是建立血液樣本庫過程中遇到的最重要的法律和倫理學問題，它是保證受試者或者血液捐贈者了解并理解試驗或研究的目的和內容，自愿同意參加試驗或研究、有權知道研究結果、并有權隨時放棄參加研究的一種書面同意書。這也是對所有進行人體研究或人體取樣調查的研究人員的倫理學要求。在以人為試驗或研究對象的領域，研究人員必須獲得知情同意，使受試者或者血液捐贈者的利益和權利得到保護，同時，這也是對研究人員的保護。

本項研究方案已通過相關醫學倫理委員會的審查和批準，在知情同意書中分析了血樣捐贈者的風險和不適，明確了權利、職責和隱私保護問題。

4 質量控制

質量控制[4]是建立艾滋病血液樣本庫的關鍵環節。給其他科研課題提供有質量保證的樣本是減少物資、人力浪費和避免重復研究的重要途徑。為保證血液樣本質量應注意以下幾點：1.制定并嚴格遵守質量控制體系文件。2.從血樣采集、分裝、運輸到保存等各個環節，都應嚴格按照標準操作規程操作。3.盡量縮短從血樣采集到保存的時間，血樣分裝應在生物安全柜進行，PBMC的分離操作嚴格按照無菌操作條件進行。4.嚴密監控冰箱、液氮罐等凍存容器的工作狀況，確保正常運行。5.標本的使用應合理、謹慎，在物盡其用的前提下，減少反復凍融次數，避免血樣浪費。

5 信息化管理[5]

建立并使用凍存標本管理系統，可有效長期、大量保存血液標本，信息化管理有以下特點：1.可添加多級目錄，便于對凍存罐所屬的小組或部門進行更好管理。2.可形象而生動的表示凍存管位置和當前凍存情況，令管理者和凍存人員對當前凍存狀況一目了然。3.可為每管樣本或細胞添加多張圖片，實現真正的圖文管理。4.既可以圖文方式打印單管樣本記錄，也可通過查找功能導出自己所需要的細胞凍存記錄，并導出至Excel文件中，方便統計、總結等工作。5.具備查找功能。可按照查找范圍、細胞名稱、凍存日期、復蘇日期、凍存者、復蘇者、備注等條件進行查找，同時也可以選擇導出至Excel文件。

6 生物安全[6]

6.1 管理體系 根據國務院《病原微生物實驗室生物安全管理條例》的規定和《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)的要求，在省衛生廳的領導和支持下，成立了由單位法人為第一負責人的生物安全管理領導小組。單位血液樣本庫團隊由實驗室分管領導、實驗室業務骨干、檢驗技術人員、中醫藥治療艾滋病研究人員和護理人員組成，經過專業培訓和學習，從事相關業務工作4年以上，具有較強的生物安全意識。

6.2 管理制度

6.2.1 為確保生物安全，制定了嚴格的管理制度，包括適用于本單位的《實驗室生物安全管理手冊》和一系列的實驗室生物安全體系文件。

6.2.2 因本單位承擔著云南省中醫藥治療艾滋病的部分患者血液檢測工作，故艾滋病血液樣本庫區采取出入庫血液樣本交接、審核、登記制度和雙人雙鎖的保管制度，嚴把庫區門戶安全。

6.2.3 對入庫標本進行嚴格的登記和到期銷毀制度。詳細登記血液樣本捐贈者信息：姓名、性別、出生日期、采集日期、采集單位等，明確標記樣本類型信息：全血(BB)、血清(BS)、血漿(BP)、白細胞(BW)、紅細胞(BE)、外周血單核細胞(PBMC)以及樣本量和編號。樣本交接單應注明樣本運輸過程中異常狀況等。

6.3 預防措施 已經向上級主管部門遞交《云南省病原微生物實驗室備案登記表》，成立實驗室突發事件應急預案管理程序，防止樣本丟失、暴力恐怖及自然災害等因素危及實驗室和血液樣本的生物安全。

7 討論

目前，大多學者認為生物樣本庫對于促進醫學研究、醫學人文、探究疾病的本質及演變規律、更好的預防和治療疾病有著重要意義。國內外生物樣本庫已逐漸向標準化、規范化、專業化、特色化、信息化、國際化、職能化方向發展，美國和歐洲的樣本庫起步較早，成立了專業性、非營利性的組織庫協會，并制定相應的協會標準，經考核合格并取得能力認證證書的人員才能參與組織庫的工作。隨著基因組學和蛋白組學的發展和人們對生物醫學資源認識的提高，國內外已形成了腫瘤庫、骨庫、眼庫、胚胎庫、干細胞庫等專業化的樣本庫，國內醫療機構雖然在腫瘤庫等方面和國外合作，建立了自己的樣本庫，但因客觀和意識的差距，仍不夠完善。提高醫療機構和科研人員利用生物醫學資源的意識是關鍵，對于有特定研究價值的血液、組織、器官及相關醫學信息都是樣本庫收集范圍，只要有低溫存儲設備和廠房，許多醫療機構都可以組建有地區特色、有病種特色的樣本庫，為地方病的防治和我國原創藥物的研發創建良好的平臺[6]。

自從2005年云南省中醫中藥研究院開展中醫藥治療艾滋病試點項目以來，對艾滋病血液樣本的采集、保存和處理一直依據生物安全等要求采取謹慎的態度，但未建立起規范的科研型血液樣本庫，未采取有效的長期保存樣本的方法，致使科研人員不能對長期治療患者進行縱向追溯研究，許多有價值的樣本無法充分利用，浪費了大量樣本資源。科學、規范管理云南省中醫藥治療艾滋病血液樣本，將為艾滋病的基礎和臨床研究提供寶貴的實物資源和病例信息共享資源，為探索中醫藥有效治療艾滋病的作用靶點和作用規律、實現樣本最大限度的開發利用提供良好的平臺，也將一定程度的實現陳賽娟院士所說的將試點項目檢測后的血液樣本“變廢土為黃金”[2]，以后筆者會繼續完善中醫藥治療艾滋病樣本庫，將DNA、RNA提取物及病理組織等納入收集范圍[7]，為云南省中醫藥治療艾滋病的研究、醫療技術、生物技術產業的發展起到促進作用。

參考文獻：

[1]張小燕.中國醫藥生物技術協會組織生物樣本庫分會成立大會會議紀要，中國醫藥生物技術，2010，5(1)：76.

[2]劉閔，翟曉梅，邱仁宗.生物信息庫的知情同意問題[J].中國醫學倫理學，2009，22(2)：31-33.

[3]S.G.Shirley，C.H.P.Durst，C.C.Fuchs，et al.A large-scale cryoelectronic system for biological sample banking[J].cryogenics，2009，49：638-642.

[4]趙娟，李鋒，李思源，等.生物樣本庫的建立與管理[J].現代生物醫學進展，2010，10(5)：999-1000.

[5]叢憲玲，孫然，王涵，等.國內外組織標本庫發展的現狀及啟示[J].中國實驗診斷學，2010，14(1)：148-150.

[6]林暉，林長纓，劉醫萌，等.科學管理傳染病生物樣本庫確保生物安全[J].首都公共衛生，2010，(4)3：140-141.

[7]萬美容，劉福民，劉小云.腫瘤組織庫的建立與管理[J].徐州醫學院學報，2009，29(2)：104-105.